تعيين رفتار تعاملی DNA تیموس گوساله با بربرين هیدروکلريد در حضور هيستون پیونددهنده : يک مطالعه بيوفيزيکی

Determining the interaction behavior of calf thymus DNA with berberine hydrochloride in the presence of linker histone: a biophysical study

Abstract

The binding of small molecules with histone-DNA complexes can cause an interference in vital cellular processes such as cell division and the growth of cancerous cells that results in apoptosis. It is significant to study the interaction of small molecules with histone-DNA complex for the purpose of better understanding their mechanism of action, as well as designing novel and more effective drug compounds. The fluorescence quenching of ct-DNA upon interaction with Berberine has determined the binding of Berberine to ct-DNA with Ksv= 9.46 107 M1 . Ksv value of ct-DNA-Berberine in the presence of H1 has been observed to be 3.10 107 M1 , indicating that the H1 has caused a reduction in the binding affinity of Berberine to ct-DNA. In the competitive emission spectrum, ethidium bromide (EB) and acridine orange (AO) have been examined as intercalators through the addition of Berberine to ct-DNA complexes, which includes ctDNA-EB and ctDNA-AO. Although in the presence of histone H1 , we have observed signs of competition through the induced changes within the emission spectra, yet there has been apparently no competition between the ligands and probes. The viscosity results have confirmed the different behaviors of interaction between ctDNA and Berberine throughout the binary and ternary systems. We have figured out the IC50 and viability percent values at three different time durations of interaction between Berberine and MCF7 cell line. The molecular experiments have been completed by achieving the results of MTT assay, which have been confirmed to be in good agreement with molecular modeling studies.

1 Introduction

Cancer is acknowledged as the collapse of cellular regulation and uncontrolled cell division. DNA carries unique genetic information about all the living creatures and controls cellular regulations, which acts as the guiding agent for the biological procedures of cells that result in transcription replication and protein synthesis (Agarwal, Jangir, & Mehrotra, 2013; Anbazhagan & Renganathan, 2008; Arrondo, Muga, Castresana, & Goni, ~ 1993; Asadi, Safaei, Ranjbar, & Hasani, 2004). Cell DNA is known as the compact form of chromatin, and among the group of proteins called histones, which are involved in the formation of chromatin, histone H1 is labeled as their most important member. Hence, the DNA and histone–DNA complex have the potential of being utilized as therapeutic goals for designing anticancer drugs (Bazett-Jones, Cot ^ e, Landel, Peterson, & Workman, 1999).

Generally, there are three different ways that the anticancer drugs can interact with DNA including binding to DNA groove (groove binding interaction), the binding between two strands of DNA (intercalation interaction) and covalent binding. Drugs with intercalation interactions can eliminate the cancer cells by creating a binding between two DNA strands (Bera, Sahoo, Ghosh, & Dasgupta, 2008; Bi et al., 2006; Blake et al., 1999; Borchman, Yappert, & Herrell, 1991; Burton et al., 1978; Cao & He, 1998; Chen et al., 2005; Chi & Liu, 2011; Du et al., 2011; Sowrirajan, Yousuf, & Enoch, 2014). We have investigated the interaction of Berberine chloride with DNA and histone H1–DNA complex throughout this study. Berberine (C20H18NO4) is a chemical compound with the molar mass of 366.36122 g/mol (Figure 1) (Gallori et al., 2000; Gittelson & Walker, 1967; Guo, Yue, & Gao, 2011; Hossain & Kumar, 2009; Huang & Zou, 2006; Ivankin, Carson, Kinney, & Wanunu, 2013; Jordan & Wilson, 2004; Kashanian et al., 2008; Khare & Pande, 2012; Kumar, Naik, Girija, Sharath, & Pradeepa, 2012; Kypr & Vorlıckova, 2002; Lerman, 1961). It has been widely studied as an isokoinoline alkaloid that belongs to the Protobebrine structural class and contains a cholesterol-like construction. In accordance with the available data, Berberine is capable of various biological and clinical activities such as antimicrobial, anticancer, antiinflammatory and antioxidant effects (Li & Dong, 2009; Macquet & Butour, 1978; Nafisi, Saboury, Keramat, Neault, & Tajmir-Riahi, 2007; Neelam, Gokara, Sudhamalla, Amooru, & Subramanyam, 2010). This particular substance can induce apoptosis through NFKB pathway and inhibit cell proliferation, as well as prevent and cause a delay in the progress of angiogenesis (Oohara & Wada, 1987). In addition, Jin et al. have studied the outcomes of Berberine on SKOV3 cancer cell line and reported that it has shown antitumor effects (Jin, Zhang, & Li, 2015). Berberine is also carried out to inhibit cancer cell proliferation by reducing the expression of BCL2 anti-apoptotic genes and increasing the expression of proapoptotic genes. Moreover, this interesting substance can induce apoptosis in the MCF-7 breast cancer cell line by causing a decrease in the expression of BCL2 and increasing the expression of CytC genes. Berberine has been widely studied and proven to contain antioxidant, antibacterial, antiTB and antitumor properties (Tang et al., 2009).

In this research, we have performed investigations on the type of interaction between Berberine chloride with DNA and histone H1–DNA complex throughout a variety of methods including fluorescence spectroscopy, absorption spectroscopy, resonance light scattering, circular dichroism (CD), melting temperature measurement, viscosity measurements, molecular modeling and 3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay

اثر افزودن مکمل فیتاز میکروبی روی جوجه های گوشتی تغذیه شده از رژیم غذایی فسفات دی کلسیم پایین

Effect of Supplementing Microbial Phytase on Broiler Chicks Fed Low Di-calcium Phosphate Diets

Abstract

For this study 195 day-old broiler chicks were randomly divided into three treatment groups with five replicates in each treatment group having 13 chicks per replicate per pen. Three iso-nitrogenous and iso-caloric rations were prepared as: R-I served as control with 0.83% di-calcium phosphate (DCP); R-II contained 50% less DCP (0.41%) than R-I and R-III contained R-II plus phytase Quantum® Blue @ 100 g/ton feed. Daily feed intake and weekly body weight gain per replicate were recorded for 35 days. On 35th day, blood and tibia bone samples from 5 birds per treatment were collected. Total weight gain and dry matter intake in chicks fed rations I, II and III were 1861, 1736 and 2023 gm/bird and 3242, 3284 and 3265 gm/bird, respectively. The chicks fed R-III got 16.00 and 8.00% higher weight gain compared to chicks fed R-II and R-I, respectively. Feed: gain ratio (gm/gm) was found best (P<0.05) in chicks fed R-III (1.61) and poorer in chicks on R-II (1.89). The concentration of Ca and P were 10.60, 9.47 and 11.43 mg/dL and 5.76, 4.91 and 7.11 mg/dL in blood serum and 32.61, 31.36 and 32.83% and 16.57, 15.92 and 16.60% in tibia bone of chicks fed rations I, II and III, respectively. The total feed cost per unit weight gain of broilers fed R-III diet was numerically 14% and 9% less than the broilers fed R-II and R-I, respectively. Results suggested that exogenous microbial phytase supplementation to rations having low DCP had positive effects on weight gain, feed: gain ratio and economic efficiency in broiler chicks. 

1 Introduction

After calcium (Ca) the second abundant mineral in animal body is phosphorus (P) and majority (80%) of the P is found in bones and teeth (NRC, 1994). The P is not only essential for bone development, growth, health, production and reproduction but it also aids in energy metabolism, synthesis of sugars and maintenance of acid-base balance in the body. However, the quantity and availability of dietary P is vital for growing animals. It is well established that phytate is the major source of P in plant based feedstuffs. Since birds are unable to produce any endogenous phytase, therefore their capability to utilize P from phytate is very limited (Woyengo et al., 2010).

Phytate is a ubiquitous component of plant sourced feed ingredients which encompasses approximately twothirds of total plant P (Hughes et al., 2009). In poultry, phytate P is normally utilized with availability from 0 to 50%, depending on age and metabolic adaptation in critical circumstances. Therefore, to meet the P requirement, generally expensive inorganic P sources are added to poultry diets. This practice leads to non-utilization of a large portion of dietary P from feedstuff and its excretion in faeces (Hughes et al., 2008; Woyengo et al., 2010) which ultimately pollutes environment. Recently, microbial phytase supplementation in poultry diets has got remarkable attention to reduce negative impact of phytate P on environment and performance of birds (Ceylan et al., 2003; Francesch and Geraert, 2009). Since phytase efficiency in the digestive tract is influenced by various factors like phytase origin, type of birds and ambient temperature etc. Therefore, each phytase preparation for poultry must be tested on broilers/layers to ensure its efficacy (Hughes et al., 2008; Onyango et al., 2005). Information regarding effect of microbial phytase addition in broiler chicks’ diet having low DCP is limited. Therefore, current study was designed to asses the effect of microbial phytase supplementation in broiler chicks fed low DCP diets on growth, economic efficiency and P contents in serum and tibia bones.

تولید پروتئین دگرسان در زیست لایه های اشرشیا کولی: یک فرم متداول کشت چگالی سلول بالا

Heterologous protein production in Escherichia coli biofilms: A non-conventional form of high cell density cultivation

چکیده
1-مقدمه
2-منابع و روشها
2-1 صفت موروثی باکتریایی، پلاسمیدها و شرایط کشت
2-2 سیستم تشکیل زیست لایه و نمونه برداری
2-3 روشهای تحلیلی
2-4 بیان پروتئین دگرسان
2-6 تحلیل آماری
3- نتایج
4- بحث
5- نتیجه گیری

چکیده

اشرشیا کولی، یکی از میزبانان مساعد برای تولید پروتئین دارای صفات ارثی جدید است و به صورت یک مدل عالی برای مطالعات زیست لایه شناخته میشود. کشتهای چگالی سلول بالای (HCDC) این باکتری، بازده های تولید حجمی جذابی را میسر میسازند و سلولهایی که در زیست لایه رشد می یابند در برخی چالشهای کشتهای پلانکتونی چگالی بالای سلول دخیل هستند.
این اثر، پتانسیل تولید سلولهای زیست لایه E.coli JM109 (DE3) را ارزیابی میکنند که یک پروتئین الگو را بیان میکنند، پروتئین فلوئورسان سبز ارتقا یافته (eGFP )، از یک پلاسمید دارای صفات ارثی متشکل جدید. یک صفت موروثی پرورش دهنده ی تیره ی پلاسمیدی یکسان اما دچار کمبود ژن eGFP برای ارزیابی اثر تولید پروتئین دگرسان بر تشکیل زیست لایه بکار رفت. نتایج نشان میدهد تولید eGFP از سلولهای زیست لایه در حدود 30 برابر بالاتر از حالت پلانکتونی بود. به علاوه، سلولهای بیان کننده ی eGFP ، تشکیل زیست لایه را در مقایسه با سلولهای کنترل ارتقا داده بودند. مقادیر تولید حجمی، دو برابر مقادیر قبلا گزارش شده با همان پروتئین بود و در طیف چیزی هستند که میتواند با HCDC در تولید پروتئینهای حلال بدست آید. گرچه چگالی بالای سلولی که بدست آمد از HCDC متداول پایین تر بود (0.5 برابر)، این سیستم نوین به مقادیر تولید خوبی دست یافت که احتمالا پس از بهینه سازی شرایط کشت، بهبود می یابند.
1- مقدمه
باکتری گیاهی گرم-منفی اشرشیا کولی، یک میزبان ارجح برای تولید پروتئینهای دارای صفات ارثی متشکل جدید محسوب میگردد که به خاطر رشد سریع آن در چگالی های بالای سلولی، شرایط مورد نیاز غذایی ساده، ژنتیک کاملا شناخته شده و دسترسی به شمار زیادی از حاملهای تولید مثل غیر جنسی و صفات موروثی میزبان جهش یافته است. این باکتری گیاهی دارای توانایی انباشته کردن بسیاری از پروتئینهای دارای صفات ارثی متشکل به حداقل 20% از پروتئین سلولی کل میباشد و در پاره ای از موارد، آنها را از سیتوپلاسم به پریپلاسم منتقل میکند. کشت ای.کولی در پرورشهای چگالی بالای سلول (HCDC)، مزایای زیادی را ارائه میدهد همانند حجم کشت کاهش یافته، فراوری پایین دست ارتقا یافته و هزینه های تولید پایین تر. با وجود این مزایا، هنوز هم چالشهای زیادی وجود دارد که باید در HCDC مورد بررسی قرار گیرند و آنها عبارتند از انتقال اکسیژن ناکافی، شرایط لازم محیط کشت ویژه، بازده ترکیب کاهش یافته در راکتور، تجمع کربن دی اکسید که مقادیر رشد تولید استات بیشتر را کاهش میدهند. تولید پروتئین دارای صفات ارثی متشکل جدید توسط سلولهای زیست لایه در برخی از چالشهای HCDC متداول بویژه پخش مواد مغذی و اکسیژن از طریق زیست لایه و هم چنین در انباشتن تولیدات ضایعات سمی دخیل است.
بیان پروتئین دارای صفات ارثی متشکل جدید در زیست لایه های ای.کولی توسط هوآنگ و همکارانش پیشتاز شد که تولید بتا-گالاکتوسیداز را در E.coli DH5a حامل یک پلاسمید حاوی ترویج دهنده ی tac بررسی کرده اند. بعدها، اُکونل و همکارانش، نخستین سیستم برای تولید پروتئین دگرسان سطح بالا را در سلولهای زیست لایه ای.کولی با استفاده از یک حامل مبتنی بر pUC برای بیان پروتئین فلوئورسان سبز ارتقا یافته (e.GFP) توصیف نموده اند. با وجود پتانسیل عظیم این سیستم بیان کننده، تولید پروتئین دگرسان از سلولهای زیست لایه ای.کولی به طور وسیعی بررسی نشده باقی می ماند.
5- نتیجه گیری
استفاده از سلولهای ای.کولی در HCDC یک شیوه ی بسیار جذاب تولید پروتئینهای دگرسان از طریق بهبود بهره وری های حجمی و کاهش سرمایه گذاری پولی و هزینه های عملیات در تاسیسات تولید است. تولید پروتئینهای دگرسان در سلولهای زیست لایه در بخشی از چالشهای HCDC دخیل است اما برخی مطالعات نشان داده اند سلولهای زیست لایه از یک ظرفیت تولید ویژه عالی برخوردارند زمانیکه با همتاهای پلانکتونی خود مقایسه میشوند. این اثر نشان میدهد سلولهای زیست لایه ای.کولی میتوانند یک پروتئین دگرسان الگو را در مقادیر بسیار بالاتر از سلولهای پلانکتونی تولید کنند و چگالی های سلولی و بهره وری های حجمی از قبل در طیف چیزی هستند که میتوانند توسط HCDC بدست آیند حتی بدون بهینه سازی شرایط کشت. اثر آینده، بهینه سازی این شرایط را برای مهار قدرت این زیست لایه های تولید کننده بررسی خواهد کرد.

Abstract

Escherichia coli is one of the favourite hosts for recombinant protein production and is recognized as an excellent model for biofilm studies. High cell density cultures (HCDC) of this bacterium enable attractive volumetric production yields and cells growing in biofilms share some of the challenges of conventional high cell density planktonic cultures. This work assesses the production potential of E. coli JM109(DE3) biofilm cells expressing a model protein, the enhanced green fluorescent protein (eGFP), from a recombinant plasmid. A control strain harbouring the same plasmid backbone but lacking the eGFP gene was used to assess the impact of heterologous protein production on biofilm formation. Results show that specific eGFP production from biofilm cells was about 30 fold higher than in planktonic state. Moreover, eGFP-expressing cells had enhanced biofilm formation compared to control cells. Volumetric production values were 2 fold higher than those previously reported with the same protein and are within the range of what can be obtained by conventional HCDC in the production of soluble proteins. Although the cellular density that was obtained was lower than in conventional HCDC (0.5 fold), this novel system reached good production values which are likely to be improved after optimization of culture conditions.

1- Introduction

The Gram-negative bacterium Escherichia coli is a preferred host for the production of recombinant proteins [1,2] due to its fast growth at high cell densities, simple nutrient requirements, well-known genetics and the availability of a large number of cloning vectors and mutant host strains [3]. This bacterium has the ability to accumulate many recombinant proteins to at least 20% of the total cell protein [4] and, in some cases, to translocate them from the cytoplasm to the periplasm [5]. E. coli cultivation in high cell density cultures (HCDC) presents many advantages such as reduced culture volume, enhanced downstream processing and lower production costs [6]. Despite these advantages, there are still many challenges that have to be addressed in HCDC and these include insufficient oxygen transfer, specific culture medium requirements, reduced mixing efficiency in the reactor, accumulation of carbon dioxide which decreases growth rates and increased acetate production [5,6]. Recombinant protein production by biofilm cells shares some of the challenges of conventional HCDC, namely in diffusion of nutrients and oxygen through the biofilm and also in the accumulation of toxic waste products [7,8]. Recombinant protein expression in E. coli biofilms was pioneered by Huang et al. [9- 11] who have studied the production of -galactosidase in E. coli DH5α carrying a plasmid containing the tac promoter. Later, O’Connell et al. [12] have described the first system for high level heterologous protein production in E. coli biofilm cells using a pUC-based vector for the expression of enhanced green fluorescent protein (eGFP). Despite the enormous potential of this expressing system, heterologous protein production from E. coli biofilm cells remains largely unexplored.

5 -Conclusions

Using E. coli cells in HCDC is a very attractive way of producing heterologous proteins by improving volumetric productivities and reducing capital investment and operation costs in production facilities. Producing heterologous proteins in biofilm cells shares some of the challenges of HCDC, but some studies have shown that biofilm cells have a superior specific producing capacity when compared to their planktonic counterparts. This work shows that E. coli biofilm cells can produce a model heterologous protein at much higher levels than planktonic cells and that the cellular densities and volumetric productivities are already within the range of what can be obtained by HCDC, even without optimization of culture conditions. Future work will address the optimization of these conditions in order to harness the power of these productive biofilms..

مقاله انگلیسی رایگان

ترجمه فارسی رایگان 

بخشی از ترجمه فارسی مقاله:

انفارکتوس های شدید میوکاردی(MI) یکی از مهم ترین علت های مرگ و میر و تلفات در سراسر جهان میباشد و تشخیص سریع و به موقع آن میتواند امکان زنده ماندن را افزایش دهد. در این کار، ما یک روش ساده، حساس و بدون برچسب و راه حل های سنسور های سیلیکن غوطه ور در محلول (SIS) مبتنی بر شرایط بدون انعکاس(NRC) برای موج های پلاریزه ی P برای تشخیص زود هنگام MI، استفاده کرده ایم. سنسور های SIS لایه های پلیمری دی الکتریک نازک بر روی سطح سیلیکنی هستند که میتوان آن ها را برای کاربرد های مختلف مورد استفاده قرار داد. در NRC، سنسور های SIS به شدت حساس به افزایش ضخامت لایه های زیستی بر سطح سنسور هستند در حالی که نسبت تغییر شاخص انکسار محیط واسط مستقل میباشد. ازین رو، سیگنال های SIS از نظر از نویز های گرمایی مستقل بوده میباشد که این موضوع بر خلاف سنسور های مبتنی بر رزونانس پلاسما میباشد. همچنین ، هیچ نیازی به سیگنال مرجع که اندازه گیری ها را ساده کند وجود ندارد. در اینجا، تکنولوژی SIS برای بررسی دو موضوع در تشخیص MI مورد استفاده قرار گرفته است : حساسیت بالا با ارزیابی مستقیم و توانایی اندازه گیری در سروم انسان. پروتئین های میوگلوبین، کیناز کراتین MB، و تروپونین قلبی (cTnI9 به عنوان نشانه های زیستی قلبی مورد استفاده قرار گرفته است. ما میتوانیم گستره ی غلظت های مختلفی را بر اساس محدوده های اندازه گیری های 5 و 10pg/ml برای cTnI در PBS و سروم خونی، به ترتیب اندازه گیری کنیم. پاسخ زمانی حدود 5 دقیقه میباشد. این روش جدید یکی از کاندید های مناسب برای کاربرد های مقرون به صرفه میباشد.
کلید واژه ها: سنسورهای SIS -انفارکتوس حاد قلب- تروپونین I- میوگلوبین- CK-MB -الیسپومتری -بیوسنسور
1. مقدمه
انفارکتوس های شدید قلبی (MI)، که معمولا به آن حمله ی قلبی گفته میشود، یکی از آسیب های بدون بازگشت به سلول های قلبی است که در اثر تامین خون ناکافی به دلیل بلوکه شدن شریان های کرونری ایجاد میشود. در سال 2012، حمله های قلبی عروقی جان نزدیک به 17.5 میلیون نفر را گرفت که 31 % از کل مرگ جهان را شامل میشود که در میان این افراد 7.4 میلیون نفر از آن ها به دلیل مشکلات کرونری به مرگ مبتلا شده بودند. تشخیص MI بیشتر مبتنی بر نشانه های درد شدید سینه و یا هر ناراحتی کهولت سن میباشد. اما، نزدیک به 28 % از مردان و 35 % از زنان هیچ کدام از این نشانه ها را نشان نمیدهند که به آن ها MI ساکت گفته میشود که این افراد در خطر بالایی هستند. رایج ترین تست ها برای بررسی شرایط این افراد استفاده از ECG و یا MRI است. این روش ها هر کدام فواید و مضرات خودشان را دارند.
بعضی از پروتئین های خاص هستند که زمانی که ماهیچه های خونی دچار مشکل میشوند، در جریان خون بیشتر مشاهده میشود. شناسایی و کمی سازی مقدار زمانی این پروتئین ها میتواند یکی از ابزار غیر تهاجمی برای شناسایی مشکلات MI شود. در میان این پروتئین ها، تروپونین انقباض ماهیچه ها را کنترل میکند که از سه زیر واحد پروتئینی ساخته شده است ؛ تروپونین I که مانع اتصال میوزین ها با اکتین میشود، تروپونین T که با تروپومیوزین فعالیت میکند و تروپونین C که با اتصال پیدا میکند. تروپونین های I و T قلبی نسبت به MI حساسیت و قابلیت تشخیصی بالایی دارند و در جریان خون به مدت طولانی باقی میمانند. ازین رو، این نشانگر های زیستی را میتوان به عنوان استاندارد های اصلی در تشخیص MI در نظر گرفت. cTnI و cTnT میتوانند اطلاعات مشابه در مورد نکروز های میوکاردی فراهم کند. اما، cTnI ها برتری کوچک اما مهمی را نسبت به توانایی تشخیص cTnT در مراحل اولیه ی MI دارند. ما از cTnI ها در کنار ایزوفرم های کراتینی کیناز MB و پروتئین های میوگلوبین به عنوان نشانگر های MI در این کار استفاده میکنیم.
سنسور های زیستی بر اساس تکنیک های رسانش نوری و الکتریکی ساخته میشنود. سنسور های الکتروشیمیایی میتوانند گونه های سیگنال های زیستی را از نظر تغییر رسانش، ظرفیت، و امپدانس شناسایی کنند. ساخت فرآیند های تولید سنسور و دستگاه های بسیار حساس ، پیچیده میباشد که تنظیمات بسیار گرانی را به دنبال دارد.
به طور کلی روش های استفاده شده برای ایجاد تقویت سیگنال و یا حذف کردن سیگنال های گرمایی بسیار پیچیده و گران میباشد. نیاز به روش های ساده تر و مقرون به صرفه تر با توانایی تشخیص مناسب، به شدت مورد نیاز است.
در این جا، ما یک سنسور مبتنی بر ارزیابی مستقیم hs-cTnI با استفاده از SIS را ایجاد کرده ایم. پلت فرم سنجش مورد استفاده مبتنی بر شرایط غیر انعکاسی (NRC) برای موج های پلاریزه ی P میباشد که زاویه های الیپسومتری به شدت حساس به ضخامت لایه ها هستند. سادگی مهم ترین ویژگی تکنولوژی SIS میباشد. چیپ های سنسور های SiS یک لایه ی پوشش یافته ی چرخشی با لایه های پلیمری بر روی یک بستر سیلیکن میباشد که میتوان آن را برای شناسایی انواع مختلفی از مولکول های زیستی مانند پپتید ها/ف پروتئین ها، و DNA استفاده کرد.

بخشی از مقاله انگلیسی:

Abstract

Acute myocardial infarction (MI) is the leading cause of high mortality and morbidity rate worldwide, early and accurate diagnosis can increase the chances of survival. In this work, we report a simple, ultrasensitive, label-free, and high-throughput solution immersed silicon (SIS) immunosensor based on non-reflection condition (NRC) for p-polarized wave for early diagnosis of MI. SIS sensor chips are just a thin dielectric polymer layer on the silicon surface, which can be functionalized for specific application. At NRC, SIS sensors are extremely sensitive to the growing thickness of a bio-layer on the sensor surface while independent of refractive index change of the surrounding medium. Therefore, SIS signal is free from thermal noise, unlike surface plasmon resonance based sensor. Also, there is no need of reference signal which facilitates fast and accurate interaction measurement. Here, SIS technology is applied to tackle two issues in MI diagnosis: high sensitivity with the direct assay and the ability to measure in human serum. Myoglobin, creatine kinase-MB, and cardiac troponin I (cTnI) proteins were used as the MI biomarkers. We were able to measure over a broad concentration range with the detection limit of 5 and 10 pg/ml for cTnI in PBS and blood serum, respectively. The response time is about 5 min. This novel technique is a suitable candidate for cost effective point-of-care application.

1. Introduction

Acute myocardial infarction (MI), commonly called as heart attack, is irreversible damage to the heart cells caused by insufficient blood supply due to blockage in the coronary arteries. In 2012, cardiovascular diseases took nearly 17.5 million lives which were 31% of total global death, among them 7.4 million were due to coronary heart diseases and the number is growing (WHO, 2015). The MI diagnosis mostly relies on its symptoms of severe chest pain or any other anginal discomfort. However, nearly 28% of men and 35% of women do not show any of these symptoms (Gutterman, 2009), known as the silent MI, are at high risk. The most common tests include electrocardiography (ECG) (Richard et al., 2012; Ahmed et al., 2007) and magnetic resonance imaging (Ahmed et al., 2013) in combination with the stress test. These methods suffer several disadvantages such as non-specificity of ST segment changes in ECG, the need of skilled technician, human error source, and time-consuming. Early, accurate, and fast diagnosis can improve risk stratification and treatment, especially during perioperative procedures, which could increase the survival rate. Certain proteins are released into the bloodstream when heart muscles get damaged, known as cardiac biomarkers. Recognition, quantification, and temporal behavior of these markers proven to be a best noninvasive tool for MI diagnosis (Janota, 2014; Jaffe et al., 2006). Among them, troponin complex regulates the muscle contraction, made up of three protein subunits: troponin I; inhibits binding of myosin with actin, troponin T; interact with tropomyosin, and troponin C; binds Ca2þ (Katrukha, 2013). Cardiac troponin I and T (cTnI and cTnT) shows high myocardial specificity and clinical sensitivity for MI (Daubert and Jeremias, 2010; Babuin and Jaffe, 2005), and remains in a bloodstream for prolonged time (Adams et al., 1993) as compared to other cardiac biomarkers. Therefore, they are considered as the gold standard in the MI diagnosis. The cTnI and cTnT can provide similar information about myocardial necrosis (Jaffe et al., 2006). However, cTnI shows small but significant superiority in diagnostic capability than cTnT in the early stage of MI (Gimenez et al., 2014). We used cTnI along with creatine kinase-MB isoform (CK-MB) and myoglobin proteins as the MI biomarkers in this work. Even though myoglobin and CK MB show insufficient myocardial specificity but their behavior can be use as a supportive information in early diagnosis and as an evidence of reinfarction. Biosensors are broadly categorized based on optical and electrical transducing techniques. Electrochemical biosensors detect biological species in terms of change in conductance (Piao et al., 2014), capacitance (Lee et al., 2016), or impedance (Radhakrishnan et al., 2014) on interaction with sensor surface. Fabrication processes of the high-sensitive (hs) electrochemical sensor devices are complex, which need expensive setup such as clean-room (Ventra and Taniguchi, 2016; Ma et al., 2013; Lee et al., 2014). Surface plasmon resonance (SPR) based biosensor are the most studied (Homola, 2008; Park et al., 2014; Lapage et al., 2013) and commercialized (Biocore, 2016) optical biosensors. SPR technique was combined with photonic crystals (Zhang et al., 2014), waveguide (Jin et al., 2016), oxide nanostructures (Tereshchenko et al., 2016), and many other signal amplification methods (Qureshi et al., 2012) to increase their sensitivity and stability. Be as it may, SPR sensors suffer from ineluctable thermal noise (Nizamov and Mirsky, 2011) which restrict their use where low molecular weight and low concentration detection involved. The methods used for signal amplification and/or to suppress thermal noise makes device structure complex and expensive. There is a need of a simple and cost effective alternative with comparable sensitivity. Here, we developed the first hs-cTnI direct assay SIS-based sensor. The sensing platform is based on the non-reflecting condition (NRC) for p-polarized wave (pseudo-Brewster angle) where ellipsometric angles ( Ψ, Δ) are highly sensitive to the overlayer thickness. Simplicity is the best feature of SIS technology. The SIS sensor chip is just a spin-coted thin dielectric polymer layer on the silicon substrate, which can be functionalized to detect a variety of biomolecules such as peptides, proteins, and DNA via affinity binding.

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

تست های کشت سلولی
برای ارزیابی جذب سلولی کورکومین، سلول های سرطانی HeLa از موسسه پاسچر تهران، ایران خریداری شد. سلولها در محیط موسوم به Roswell Park Memorial ( شهری در نیو مکزیکو) با 10٪ سرم جنین گاوی و 1٪ پنی سیلین / استرپتومایسین در 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور CO2 کشت داده شدند. سلول ها با غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر آزاد کورکومین یا بارگیری و ترکیب شدند. پس از 24 ساعت، سلولهای مورد آزمایش با PBS شسته شدند و سپس تحت میکروسکوپ فلورسانس معکوس بررسی شدند. (ابزار نیکون، ملویل، نیویورک، ایالات متحده آمریکا). به منظور ارزيابي اثرات سيتوتوكسيك نيتروژن كركومين، فيبروبلاست هاي فوربك پوست انسان و سلول هاي HeLa با تراكم 103 × 7 ميكروليتر در صفحات 96 كيلويي بذر كشت داده شدند و با غلظت هاي متفاوت كركومين آزاد و كپسول شده به مدت 48 ساعت انكوبه شدند. سپس (MTT 5 میلی گرم بر میلی لیتر) به هر چاه اضافه شد و سلول ها در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 4 ساعت انکوباتور شدند. برای حل شدن رسوب فرانسان آبی، دی متیل سولفوکسید اضافه شد و جذب در 570 نانومتر توسط یک ارزیابی کننده ELISA (BioTek، Winooski، VT، USA) تعیین شد. 

رنگ آمیزی هسته ای
همانند آزمایش MTT، سلول از خط سلولی HeLa کشت شدند و به مدت 48 ساعت با NP خالص، کورکومین یا NPC های کورکومین انکوباتور شدند. سپس، سلول ها با PBS شسته شدند و با پروما فرمالدئید 4٪ ثابت به مدت 20 دقیقه ثابت می شدند. پس از شستشو با PBS، برای افزایش نفوذ پذیری، 0.2٪ Triton X-100 به مدت 20 دقیقه اضافه شد؛ در مرحله نهایی، رنگ آمیزی هسته ای به مدت 25 دقیقه با استفاده از DAPI (1 میکروگرم در میلی لیتر سانتا کروز بیوتکنولوژی، سانتا کروز، CA، USA) انجام شد و سلول ها تحت یک میکروسکوپ فلورسنت (نیکون) مشاهده شدند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی کمی (qRT-PCR)
سلول های HeLa به مدت 48 ساعت با NP های خالی، کورکومین و CF-ALG-STPP NPC (50 میکروگرم بر میلی لیتر) کورکومین انکوباتور شدند. سپس آنها با PBS شسته شدند و RNA با استفاده از کل کیت استخراج RNAیکتا تاجیز، تهران، ایران) بر اساس پروتکل تولید کننده استخراج شد. سنتز cDNA با استفاده از کیت رونویسی شده معکوس تجاری (یکتا تاجیز) انجام شد. در مجموع 20 میکرولیتر مخلوط واکنش حاوی 4/0 میکروگرم پرایمر جلو، 0.4 میکروگرم مبدل برگشتی، 2 میلی لیتر cDNA، 10 میکرو لیتر SYBR سبز PCR ترکیبی اصلی(یکتا تاجیز)، 0.4 میکرولیتر کربوکسی-ادرادامین (یکتا تاجیز) و 6.8 میلی لیتر RNase آب آزاد GAPDH به عنوان یک کنترل داخلی مورد استفاده قرار گرفت. سطح ویژگی ژن با روش Ct تجزیه و تحلیل شد. جدول S1 توالی پرایمر و دمای آنیلینگ را نشان می دهد.

تحلیل آماری
داده های آزمون MTT با استفاده از آزمون آماری t مستقل تجزیه و تحلیل شد. نتایج qRT-PCR با استفاده از تجزیه واریانس یک طرفه و سپس پس آزمون توکی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتايج به صورت ميانگين ± خطاي استاندارد ميانگين و p-value 0.05 به صورت آماري معني دار در نظر گرفته شدند.

نتایج
خواص نانوذرات CS -ALG -STPP NPC حاوی کورکومین
نتایج FE-SEM نشان داد که NP-CFC-ALG-STPP دارای کورکومین کروی و اندازه متوسط ~ 50 نانومتر است که با یکدیگر جمع و متراکم می شوند (شکل 1A. ). شکل 1B یک تصویر AFM و نمای سه بعدی آن را نمایش می دهد. مطابق با داده های FE-SEM، اندازه گیری نتایج AFM نیز نشان می دهد که ذرات دارای توزیع اندازه یکنواخت هستند و اندازه های متوسط نانوذرات کورکومین بارگذاری شده 50 نانومتر است (شکل 1C.)

تجزیه و تحلیل طیف سنجی FT-IR
شکل 2 طیف های FT-IR از کورکومین، CS-ALG-STPP و NC-ALG-STPP ترکیب شده کورکومین را نشان می دهد. در طیف نانوذرات CS-ALG-STPP، گروه وسیعی در 3،432 cm-1 به گروه هیدروکسیل و آمین مربوط می شود.

رئوس یا پیکهای نزدیک به 1630 و 1413 سانتیمتر مربع به ارتعاشات متقارن و نامتقارن کششی گروه های COO اختصاص یافته است. علاوه بر این، باند حدود 1،026 cm-1 متعلق به باندهای آمید است. اوج 1،087 cm-1 به علت وجود -CH-OH در الکل سیلیکونی و کشش C-O است. برای کورکومین، پیک در 3،478 سانتیمتر 1 مربوط به گروه های آمین است. پیک جذب در 1510 سانتیمتر مشاهده می شود که مربوط به ارتعاشات C = O و C = C کورکومین است.
علاوه بر این، پیک جذب برای باندهای دوگانه C = C در 1 627 cm-1 در این طیف به دلیل همپوشانی با اوج CS-ALG-STPP واضح نیست. شدت اوج نسبی نانوذراتCFC-ALG-STPP کورکومین کمی ضعیف است، که ممکن است به دلیل وابستگی کورکومین به گروههای کاربردی ماتریس CS-ALG باشد.

راندمان جذب
برای ارزیابی کارایی انکپسولاسيون، تجزیه HPLC بر روی محلول ریخته شده، محلول پس از شستشو با اتانول و مخلوط نانوذراتCS-ALG-STPP کرکومین در آب انجام شد. با محاسبه منطقه زیر پیک، بازده نهایی برای آماده سازی NP حدود 70٪ بود (شکل 3).

انتشار کورکومین در محیط آزمایشگاهی از CS -ALG -STPP NP
مشخصات آزمایشی دارو در یک زمان معین مورد بررسی قرار گرفت و درصد کورکومین آزاد شده از NP-CS-ALG-STPP با استفاده از منحنی استاندارد اندازه گیری شد. شکل 4 آزمایشی آزمایشی داروی NPc کرکومین را نشان می دهد. داده های ما نشان داد که 24٪ و 29٪ از کورکومین پس از 1 و 2 ساعت از NP ها ، به ترتیب آزاد می شوند. سپس، رهاسازی کنترل شده شديد تا 24 ساعت مشاهده شد و 53٪ از کورکومين بارور شده فيزيکي در اين دوره آزاد شد (شکل 4).

جذب کورکومین و نانوذرات CS -ALG -STPP
فرایند ایزوترم برای ارزیابی ظرفیت بارگیری کورکومین بر روی NP-CS-ALG-STPP انجام شد. شکل 5، ایزوترم جذب برای کورکومین و NP-CS-ALG-STPP را نشان می دهد. نتایج تجربی مناسب با معادلات ایزوترم لانگمویار، فروندلیچ، تمکین، الوویچ و لانگمویر فروندلیچ بودند. جدول 1 داده های ایزوترم جذب برای کورکومین را در NP-CS-ALG-STPP و پارامترهای تعادلی نشان می دهد. تجزیه و تحلیل رگرسیون نشان داد که در بین ایزوترم های ذکر شده، مدل ایزوترم لانگموری-فروندلیچ بیشترین خطی بودن را نشان می دهد (R2 = 992).

آزمایشات درون آزمایشگاهی
بر اساس فعالیت فلورسانس ذاتی کورکومین، جذب آن در سلول های HeLa، 48 ساعت پس از انکوباسیون NPC-ALG-STPP NPC کورکومین مورد بررسی قرار گرفت. تصاویر میکروسکوپی فلورسنس نشان داد که سلول های کنترل و آنهایی که با NP-CS-ALG-STPP انکوباتور به عنوان گروه آزمایشی خالی نانوذرات هیچ فعالیت فلورسانس نشان نمی دهد. در مقایسه با گروه های آزمایشی کنترل و خالی ناقل NP ، سلول های HeLa که با آزاد کورکومین یا NPC کروکومین (50 میکروگرم بر میلی لیتر) تحت درمان با فلورسانس سبز قرار گرفته اند (شکل 6A). در مرحله بعد، اثر سیتوتوکسی NPs کرکومین بارگذاری شده با استفاده از آزمون MTT ارزیابی شد. فیبروبلاست های پیش پوست انسان و سلول های HeLa به مدت 48 ساعت با دوزهای مختلف کربوکامین آزاد یا کورکومین بارگذاری نشده CS-ALG-STPP NP (6.25، 12.5، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلی لیتر) انکوباتور شدند. برای ارزیابی سمیت نارسایی های کورکومین بر روی سلول های طبیعی، فیبروبلاست های فورنچه پوست انسان کشت شدند و با غلظت های مختلف کورکومین نانوذرات ترکیبی با کورکومین به مدت 48 ساعت انکوباتور شدند. نتایج حاصل از MTT نشان داد که اثر سیتوتوکسیک قابل توجه در درمان سلول های کروموزوم طبیعی تحت درمان با نانوذرات کورکومین یا نانوذرات ترکیبی با کورکومین (شکل 6B) مشخص نشد. علاوه بر این، اثر سیتوتوکسی NP در بیماران مبتلا به سرطان HeLa مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آزمون زنده ماندن سلول نشان می دهد که NPs کرکومین بارگذاری شده، به ویژه دوز بالای آن ، اثر بازدارنده وابسته به دوز ، به تکثیر سلولی نسبت به گروه کوروکوم آزاد داشت (شکل 6B).

تعیین مشخصات و شناسایی LAB احتمالی پروبیوتیکی با فعالیت فیتاز

Screening, Characterization and Identification of Probiotic Potential LAB with Phytase Activity

Abstract

Probiotics have been extensively studied and explored commercially in many different products in the world. Looking to the demand and health prospects extensive screening for Lactic Acid Bacteria (LAB) with probiotic potentials was investigated. Total 57 bacterial isolates were collected from the 32 samples. Out of which, 33 LAB isolates were confirmed on the basis of morphological and preliminary biochemical characterization. On the basis of probiotic traits such as low pH and high bile salt tolerance, 8 LAB isolates with probiotic potentials were selected. These were further evaluated for phytase activity which is very important for availing various minerals and proteins in the gut. Two LAB isolates found to show significant phytase activity. Considering the probiotic potential along with phytase activity these isolates show health prospects and therefore they were characterized for identification. Morphological, biochemical and molecular characterization studies revealed Isolate 21 as strain of Pediococcus acidilactici (KU173544) and Isolate 24 (KU173545) as a strain of Pediococcus lolii.

1 Introduction

According to world health organization probiotics defined as “live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health benefit on the host”. There is growing evidence for their efficacy in protecting against acute diarrhoeal disease in children, gastroenteritis and antibioticassociated diarrhoea, inflammatory bowel diseases and pouchitis (Reid et al., 2003; Geier et al., 2007; Nomoto K., 2005; Weng and Walker, 2006). There is also evidence to support further investigation of the use of probiotics and prebiotics in the treatment of illnesses affecting sites other than the intestinal tract, e.g. urinary tract infections, vaginal infections, arthritis, atopic eczema, pharyngitis and otitis media (Reid et al., 2003; Geier et al., 2007; Tagg and Dierksen, 2003; Lenoir et al., 2007).The numerous perceived health benefits and the growing awareness about probiotics have caught the attention of the food industry (Saarela et al., 2002; Salminen and Gueimonde, 2004). Food companies are increasingly manufacturing foods with incorporated probiotic bacteria, which fall under the new category of foods so called functional foods. Probiotic dairy products such as yogurts containing L. acidophilus and Bifidobacterium spp. constitute a significant amount among the commercially available probiotic foods (Reid et. al., 2003). The goal of functional foods is to improve the quality of life, enhance health status and increase lifespan while maintain health preventing diseases.

Besides imparting all these beneficial attributes probiotics are also known to produce various enzymes that help in the digestion of monogastric animals, phytases and lipases being the important ones. Phytic acid (myo-inositol hexakis phosphate, phytate) is the major storage form of phosphorus in cereals, oil and legumes (Khattak et al., 2006). Phytase, a specific group of phosphatase, hydrolyses phytic acid to myo-inositol and phosphoric acid. In the context of human and animal nutrition, two aspects of phytate are critically important (Reddy et al. 1982; Wodzinski and Ullah, 1996): (i)monogastric animals have only low levels of phytate-degrading enzymes in their digestive tracts, and since phytic acid itself is not absorbed. (ii) phytic acid is considered to be an anti-nutrient factor as it forms complexes with proteins and a variety of metal ions and therefore decreases the dietary availability of these nutrients. Because of these problems, there is considerable interest in phytate-degrading enzymes. Inorganic phosphate is therefore added to their diet to meet the phosphorus requirement, while undigested phytate phosphorus is excreted in manure and poses a serious phosphorus pollution problem, contributing to the eutrophication of surface water in areas of intensive livestock production (Bajaj and Wani, 2011). The formation of insoluble mineral-phytate complexes at physiological pH values is regarded as the major reason for the poor mineral bioavailability, because these complexes are essentially non absorbable from the human gastrointestinal tract (Greiner and Konietzny, 2006). Minerals are involved in activation of intracellular and extracellular enzymes, in regulation of critical pH levels in body fluids necessary for the control of metabolic reactions and in osmotic balance between the cell and its environment. A deficiency of any one of the essential minerals can result in severe metabolic disorders and compromise the health of the organism. Some minerals deficiencies are common in developing countries, but mineral sub-deficiencies may also occur in developed countries (Lopez et al., 2002).

The objectives of present studies were to isolate and identify phytase producing probiotic potential LABs for its exploitation for better health prospects.

تقویت تولید فیتاز از یک سوش جدید پروبیوتیک Bacillus Subtilis P6

Enhancement of Phytase Production from a New Probiotic Strain Bacillus subtilis P6

Abstract

An integrated classical and statistical optimization approach involving the combination of Placket–Burman design (PBD) and Central Composite Design (CCD) was employed for increasing phytase yield. PBD was used to evaluate the effect of 9 variables related to phytase production from probiotic strain B. subtilis, and three statistically significant variables, namely, glucose, beef extract and potassium phosphate were selected for further optimization studies. The levels of five variables for maximum phytase production were determined by a CCD. The optimum values for the factors were determined via response surface methodology (RSM) as: 6.59 gl-1 of glucose, 6 gl-1 of beef extract and 2.75 gl-1 of potassium phosphate respectively. Phytase production improved from 2.74 EUml-1 to 46.76 EUml-1 indicating 17-fold increase in activity after optimization.

1 Introduction

The growing awareness of the diet and health has prompted an increasing demand of food products that can support health apart from providing basic nutrition (Haros et al., 2009). Since last six decades, a lot of antibiotics have been incorporated in animal feed to improve their growth, efficiency and to protect them from pathogenic microorganisms.

But, antibiotic resistance has become a major public health concern today (Sharma et al., 2014). The gastrointestinal microflora plays beneficial role in the health and nutrition of animals, and probiotics, live microorganisms help in the maintenance of gut microflora. Probiotics have been strongly recommended as alternatives to antibiotics for food animals (Reid and Friendship, 2002). Recently, a great deal of attention has been devoted to the genuine value of bacterial species as multifunctional probiotics, which secrete various extracellular enzymes for enhancing feed digestibility as well as many antimicrobial compounds for improving animal performance (Lee et al., 2012); among them phytase holds the key position. Phytate is a natural phosphate reservoir in plant based animal feed and acts as an anti-nutritional factor in gut of animals and humans by restricting absorption of proteins, carbohydrates, amino acids and metals viz. Zn2+, Fe3+, Ca2+ and Mg2+ . However, in order to meet the phosphorus requirement, diet of monogastric animals are supplemented with inorganic phosphorus which causes the excretion of large amount of phosphorus in the excreta resulting in environmental pollution and several human health problems (Jorquera et al., 2011). Phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase, E.C. 3.1.3.8 or E.C. 3.1.3.26) are group of enzymes that hydrolyze phytate to inositol phosphate, myo-inositol and inorganic phosphate. Today, phytase extracted from fungi (Nautophos® , Allzyme® SSF, Finase® P/L) is commercialized as feed supplement; on the other hand several bacterial species have been used as probiotics.

But till date, phytase producing probiotic strains have not been commercialized. However, a probiotic strain with phytase activity can perform double function and enhance productivity of animals manifolds. Simultaneously, they can also reduce the serious environmental problems caused by undigested phytate, which is main byproduct of human and animal excreta. Hence, from last few years, this area has become a major public health concern and is drawing the interest of health and research professionals all around the world.

One of the major cornerstones in biotechnology today is the optimization of the cultivation conditions for enhancing the productivity. Screening and evaluation of nutritional requirements of microorganisms is an important step in any bioprocess development.

Optimization studies involving one factor-ata-time approach is tedious, tends to overlook the interaction among the factors and might lead to misinterpretation of results. In contrast, statistical strategies are preferred and more advantageous and mitigate the error in determining the effects of parameters in an economical manner (Sharma and Satyanarayana, 2006). The empirical technique is a traditional optimization method employing one-factor-at-a-time strategies which is simple, easy and explains the individual effect of different components. Unfortunately, it is tedious and fails to explain the interactions among the factors (Awad et al., 2011). Statistical optimization is a proven tool for overcoming the limitations of the “one-factor at a time‟ method. It is more efficient technique since it can provide statistical data with a relatively small number of experiments.

In our previous endeavor, we isolated phytase producing potential probiotic strain Bacillus subtilis P6 from exotic environment (Sharma and Trivedi, 2015). Considering the high potential of phytase for use as feed supplement and its future prospective in animal feed and human nutrition, the present appraisal therefore aims at achieving the multifold improvement in the phytase production through sequential classical and statistical optimization strategy from probiotic strain Bacillus subtilis P6 so as to verify whether it can become a new kind of feed additive for food and animal feeding in the future.

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

در کل، دومین های غشایی قطبیده در بسیاری از انواع سلولها به وسیله ی انواع خاصی از داربست های غشایی سازمان می یابند. شکل 1 یک ساختار عمومی از داربست غشایی را نشان میدهد. این ساختار میتواند به لایه های عملکردی تقسیم شود. با شروع از بخش خارج سلولی ، اکتودومین های گیرنده های گذرنده از عرض غشاء با افکتورهای متحرک و ساختارهای ثابت میانکنش می کنند. چگونگی اتصال لیگاند گذرنده از عرض غشاء برای القای به خدمت گرفتن آداپتور کاملا معلوم نیست.اغلب، اتصال لیگاند با دایمریزاسیون گیرنده همراه است. در طرف داخل سلولی، پروتیین های اداپتور موتیف های پپتیدی را در دنباله های سیتوپلاسمی گیرنده ها شناسایی می کنند. بیشتر پروتیین های آداپتور دارای تعدادی میانکنش های پروتیین-پروتیین هستند که منجر به منزوی شدن بقیه ی پروتیین های ترانس ممبران، سایر داربست ها ، مولکول های پیام رسان و فیلامنتهای اکتین می شود. علاوه براین مولکول های داربست کننده میتوانند به طور مستقیم از طریق موتیف های متصل شونده به لیپید با پروتیین میانکنش کنند. وابستگی متقابل فضا-زمانی این شبکه ی میانکنشی شامل بازخوردهای مثبت و منفی است از طریق تعیین هویت مولکولی و ساختار و عملکرد دومین ممبران مربوطه است. به ویژه اینکه این گردهمایی ها بوسیله ی نانوکلاسترهای لیپیدی حاوی کلسترول، PIP2 و یا هر دو ماجول می شود. چنین کلاسترهایی فقط به اسکلت سلولی متصل نمی شوند بلکه پروتیین های پلیمریزاسیون اکتین را جذب و ساختار اسکلت سلولی را ماجوله می کند. درگیر کردن این شبکه های میانکنشی در فضا و زمان نیازمند یک اتصال سیستماتیکی از روش های آزمایشگاهی و مدل سازی جدید است. نمونه های داربست های غشایی مهم اتصالات ماتریکس سلولی( چسبندگی کانونی) اتصالات سول-سلول (ادهرنس، محکم و اتصالات عصبی و دسموزوم ها) و برآمدگی های غشایی قطبیده (لاملی پودیا، آکسون، border,brush و پرزهای سلولهای اپیتلیال) هستند.

اینکه داربست های غشایی چگونه می توانند بر تفکیک پروتیین ها و لیپیدهای غشایی در مقیاس نانو تاثیر بگدارند در مطالعه ی منی توسط گروه Kusumi’s نشان داده شده است. ردیابی تک ذره ای سریع پروتیین های ترانس ممبران و آنالوگ های لیپیدهای لایه ی خارجی غشاء یک الگوی انتشار محدود در مقیاس فضایی محدود در زیر حد پراش میکروسکوپ نوری نشان داد. پروتیین ها و لیپیدهای غشاء به صورت موضعی سریع حرکت میکنند( کمتر از 60 تا 200 نانومتر) اما در هر بخش قبل از جهیدن به بخش همسایه بیش از یک میلی ثانیه باقی می مانند. Aki Kusumi این الگوی انتشار را انتشار هاپ نامید و پیشنهاد کرد که فیلامنت های اکتین متصل شونده به غشاء که در سطح سیتوپلاسمی غشاء قرار دارند ، به عنوان مرزهایی برای پروتیین های ترانس ممبران در حال انتشار عمل می کنند. علاوه بر این پروتیین های غشایی که که اسکلت سلولی را به غشاء سلولی لنگر می کنند به عنوان موانعی درون صفحه ی غشاء عمل می کنند که انتشار لیپیدها حتی در لایه ی خارجی را نیز محدود می کند. این یافته که بسیاری از پروتیین ها می توانند بین وضعیت متصل به اکتین یا غیر متصل به اکتین تغییر کنند یک مدل جامعی را ایجاد می کند که بسیاری از این دینامیک های غشایی مشاهده شده را توضیح می دهد.
شبیه سازی ها و آزمایشات اخیر نشان می دهد که داربست های غشایی میتواند بر سازماندهی لیپیدها اثر نیرومندی داشته باشد که بسیار فراتر از موانع انتشار منفعل است. در غشاءهای پیچیده که به فا گذر نزدیک هستند ، پین گذاری اجزاء سازنده ی غشاء با یک داربست می تواند دومین های لیپید را تحریک یا سرکوب کند که به دما و الگوی پین گذاری بستگی دارد. شبیه سازی های ساده ی مدل دوبعدی آیزینگ رفتار انتقال فاز و غشاءهای مدل سه تایی و حتی وزیکول های پیچیده ی مشتق شده از سلول را نشان داده است. شبیه سازی های پیشرفته تر پیش بینی کرده اند که پین گذاری فضا زمان اجزاء تشکیل دهنده ی غشاء منجر به از دست رفتن گسترده و حتی کامل انتقال فاز خواهد شد. این مکانیزم از ماده چگال و فیزیک آماری به عنوان اختلال در فرو نشستن شناخته شده است و در مواد شیشه مانند و انتقال فرومغناطیس مطالعه شده است. پیش بینی های in-silico برای غشاءهای لیپیدی اخیرا در بسیاری از روش های آزمایشگاهی (in vitro) اثبات شده است. با استفاده از چسبندگی به عنوان منبع پین گذاری لیپید در وزیکول های تک سلولی غول پیکر در تفکیک فاز ، Zhao و همکاراراان دادن که در دمای بالاتر از دمای انتقال فاز دومین های لیپیدی در محل های چسبندگی پایدار می شوند. Honigmann و همکارانش از یک کورتکس مصنوعی استفاده کردد که به یک غشاء حمایت شده با لنگرهای لیپیدی متصل بود. مطابق شبیه سازی ها، پین گذاری با meshwork های اکتین متراکم از تفکیک فاز بزرگ مقیاس در دمای پایین جلوگیری کرده و دومین های لیپید را در دماهای بالا تثبیت می کند. با استفاده از روشی مشابه ، Arumugam و همکارانش به نتیجه ی مشابهی درمورد GUVs رسیدند.
کار incilico و in vitro به وضوح نشان نشان میدهد که یک مکانیسم نامظلوب خاموش شده میتواند برای توصیف وضعیت فیزیولوژیک غشاءهای سلولی مهم باشد. این مشاهدات به وسیله ی مشاهدات تفکیک فاز مقیاس وسیع وزیک.ل های مشتق شده از غشاء پلاسمایی که برخی از پروتیین ها و لیپیدهای غشاء را دارد ولی فاقد ارتباط با کورتکس سلول است حمایت می شود. این قضیه نشان میدهد که در سلول های سالم ، تفکیک در مقیاس وسیع به وسیله ی کورتکس ممانعت میشود. در راستای این پیش بینی ها ،چندین مطالعه ی گزارش شده در مورد ناهمگنی های غشاء و رفت های لیپیدی به این نتیجه رسید که دپلیمریزاسیون اکتین منجر به ایجاد غشاء همگن در دمای فیزیولوژیک می شود.
علاوه بر این، کورتکس به طور پیوسته با دپلیمریزاسیون اکتین و فیبرهای میکروتوبولی و حرکات مبتنی بر موتور پروتیین ها بازآرایی می شود. Satyajit Mayor اخیرا مدلی را پیشنهاد کرده است که نقش رشته ی کوتاه اکتین متحرک برای ایجاد دومین های لیپیدی trans-leaflet را تعیین می کند. رشته های کوتاه اکتین که با پروتیین-های آداپتور به لیپید فسفاتیدیل سرین حاوی زنجیره های آسیل بلند و اشباع متصل می شود میتواند باعث القای کلاسترهای پروتیین لنگرشده با GPI بر روی لایه ی خارجی غشاء پلاسمایی شود.

تشکیل دومین های پیام رسانی
در طول پیام رسانی سلولی اطلاعات باید در طول غشاء انتقال داده شود تا پاسخ سلولی ایجاد گردد. ینکه چگونه پیام هایی از یک گیرنده ی واحد با هم ترکیب می شوند تا تصمیم های سلولی کلی ایجاد کنند هنوز کاملا درک نشده است. مثال هایی از فرایندهای پیام رسانی که به خوبی مطالعه شذه اند نشان میدهد که مراحل تکثیر برای ترجمه ی اتفاقات فعال سازی یک گیرنده ی واحد به تنظیمات رونویسی لازم هستند. با توجه پیشرفتهای فسفوپروتئومیکس، این موضوع در حال روشن شدن است که دیدگاه قدیمی که با شمای ساده ای از واکنش های خطی آبشار پیام رسانی را توصیف می کرد باید با مدل های متغییر جایگزین شود که در آنها تصمیم گیری ها نتیجه-ی میانکنش های پیچیده ای در شبکه های در هم تنیده است. علاوه بر این ، در سال های اخیر، روشن شده است که بسیاری از فرایند های پایین دست در آبشار پیام رسانی بعد از فعال سازی گیرنده در حقیقت به طور مستقیم در محل فعال سازی گیرنده جایگیری می کند. این کار از طریق تشکیل کلاسترهای پیام رسانی به دست میآید که حاوی گیرنده های فعال شده ی چندگانه و مولکول های داربستی است که به صورت گذرا به خدمت گرفته می شود و کینازها و سایر پروتیین های پیام رسانی باهم ترکیب می کند. کلاستر کل با بازآرایی اکتین-کورتکس پایدار شده و در نهایت با اندوسیتوزیس غیرفعال می گردد. برایی بردن به اینکه کدام مکانیسم در حقیقت تشکیل و پایان این کلاسترهای پیام رسانی را به پیش می برد باید به اصول سازماندهی غشاء و میانکنش آن با کورتکس برگشت.
بسیاری از مکانیسم های سازماندهی غشاء که در پاراگراف های قبلی معرفی شدند در تشکیل دومین های پیام رسانی دخیل هستند. از میان انواع مخالف گیرنده های قرار گرفته در غشاء پلاسمایی ، برخی از گیرنده ها ممکن است به صورت واحدهای مستقل عمل کنند مانند کانال های یونی ولتاژی، و برخی از گیرنده های جور شده با پروتیین های G. با این وجود برخی از گیرنده ها از جمله کینازهای تیروزین، نیازمند دیمریزاسیون القا شده با لیگاند برای انتقال پیام هستند. به نظر می رسد که دیمریزاسیون و مرحله ی فسفریلاسیون بعد از آن تحت تاثیر محیط موضعی غشاء قرار می گیرد. گیرنده های متصل به GPI ،که تنها به لایه ی خارجی غشاء متصل هستند به نظر میرسد که با کلاستر کردن و تشکل رفت های لیپیدی پیام رسانی می کنند که کلاستر را از طریق جفت کردن دولایه از لایه ی خارجی به لایه ی اخلی منتقل می کند.
در کل، کلاستر شدن گیرنده ی فعال شده راهی را برای بهینه کردن پیام رسانی به نیازهای خاص است: 1) پیام رسانی تعاونی گیرنده های آشفته را به یک سیستم متمرکز تبدیل می کنند. II) تصال پی در پی یک لیگاند ضعیف به یک دسته از گیرنده ها باعث تکثیر و افزایش حساسیت می شود III) کلاستر شدن گذرا امکان سوئیچینگ بین پیام های موضعی و پوشش فضای بیشتر را فراهم می کند. عملکردهای ویژه اندازه، دینامیک و سازماندهی کلاسترها را تکامل بخشیده است. مدل سازی نشان داد که کلاستر 4 تا 8 پروتیین تعاونی به صورت بهینه یک سیگنال را با تمرکز بالا با گیرنده های آشفته از عرض غشاء و با حداقل انرژی فعال سازی عبور میدهند. کلاستر پروتیین های CD59 لنگر شده به GPI با جمع شدن 3 تا 9 پروتیین CD59 لنگر شده به GPI یک کلاستر واحد را تشکیل میدهند در حالیکه کلاسترهای GTPase Ras دارای حدودا 6 مولکول هستند. کلاسترهای کوچک برای افزایش تمرکز مناسب تر هستند زیرا ، جمع شدن و باز شدن سریع امکان انتشار سریع برای پوشش فضایی گسترده را فراهم می کند.
همانطور که در بالا بحث شد، تغییرات کوچک در ماینکنش های بین مولکولی به راحتی منجر به تفکیک موضعی اجزاء غشاء و تشکیل نانودومین ها می شود. برای تشکیل نانودومین های پیام رسانی گذرا ، برخی از ویژگی ها مولکول های پیام رسان ممکن است با رویداد پیام رسانی مدوله شود. برای مثال شیب دومین های گذرنده از عرض غشاء برای برخی از کانال های یونی و گیرنده در طی فعال سازی تغییر میکند که نشان میدهد که آنها اکنون ضخامت غشایی متفاوتی را ترجیح میدهند. همچنین ، سایر فرایندهای فعال سازی مانند فسفریلاسیون یا پلیمریزاسیون، بار یا سطح آبگریزی پروتین های غشاء را تغییر میدهند و به این ترتیب تمایل آنها به محیط های موضعی خاص را تحت تاثیر قرار می دهند. این مکانیسم ها می تواند شروع تشکیل کلاسترهایگیرنده های فعال شده را به پیش ببرد. علاوه بر این پلیمریزاسیون فعال با مصرف انرژی و کینتیک های واکنش موضوع مطالعات اخیر بوده است. همکاری بین گروه های Ron Vale و Michael Rosen اخیرا نشان داده است که چگونه فسفریلاسیون گیرنده ی سلول-T با پروتیین های پایین دست شناسایی شده و با کمک آداپتورهای مالتی والانت و پروتیین های داربستی و اسکلت سلولی اکتین به کلاستر پیام رسان تبدیل می شود. داربست کننده ها و اداپتورها به مولکول های موضعی و گذرا مانند کیناز و سایر مولکول های پیام رسان امکان منزوی شدن را می دهد. جالب توجه است که گردهمایی کلاسترهای پیام رسان با پروتیین های داربست به نظر میرسد که بر جدا سازی فاز مایع پروتیین های داربستی چندظرفیتی متکی باشند که امکان تکثیر و تشکیل محیط واکنش ویژه را فراهم کرده و از نظر فرضی بسیار شبیه به جیزی است که برای جداسازی فازها برای لیپیدها و پروتیین های درون غشاء پیشنهاد شده است. بالانر از این، جریان مولکولی ناشی از پروتیین های موتوری برای پلت فرمهای ریز پیام رسانی مانند سیناپس ایمیونولوژیکی ، و ممکن است حتی در دومین های کوچکتر هم اتفاق بیافتد.
نقش لیپیدها در تشکیل کلاسترهای پیام رسانی در لایه ی داخلی غشاء شناخته شده تر است، در اینجا کلاستری شدن بیشتر به وسیله ی میانکنش های الکترواستاتیکی بین کاتیون های دو ظرفیتی یا موتیف های پروتیینی پلی بازیک که اغلب در مجاورت بخش سیتوپلاسمی غشاء و گروهای لیپیدی دارای بار منفی یافت می شوند. پیشنهاد شده است که یون های دو ظرفیتی مانند شارش کلسیم در حین پیام رسانی میتواند این لیپیدهای باردار را گردهم آورد و لوپ های فیدبک احتمالی بوجود آورد. مراحل مختلف فسفریلاسیون PIP میتواند به وسیله ی دومین های متصل شونده به لیپید مانند دومین همولوژی Pleckstrin ، دومین های C2 و یا دومین های PDZ به طور اختصاصی سازماندهیشود که برای مثال به عنوان آداپتورهای ردیاب اختصاصی جایگاه برای وزیکول های سیناپسی در نورون یا به عنوان مدول های مختلف داربست های پیام رسانی چند ظرفیتی عمل می کنند این نانوکلاسترهای PIP2 ارتباط بین غشاء و اسکلت سلولی را قویتر کرده و به حرکت پیام از غشاء سلولی به سمت هسته کمک کند.
در سلولهای سالم ، رشد دومین، به وسیله ی پین گذاری دومین ها از طریق میانکنش ها در زیر اسکلت سلولی محدود میشود ، مگر اینکه فرایند از بازآرایی فعال اسکلت سلولی استفاده کند. به تدریج اتفاق پیام رسانی مجبور به پایان رسیدن است و نانودومین ها باید از هم جدا شوند. راه انداز این فرایند ناشناخته است و میتواند از اثرات فیدبک اتفاقات پایین دست باشد. با این وجود ، ساده ترین راه انداز میتواند اندازه ی نانو دومین و هماهنگی ان با اسکلت سلولی کورتکسی باشد. قانون متداول برای حذف کمپلکس پیام رسانی فعال شده اندوسیتوز است. که میتواند با افزایش پلیمریزاسیون اکتین بر روی نانو دومین های درحال رشد بر روی لایه ی داخلی غشاء راه بیافتد.

عملکرد، کیفیت بستر و انتشار بوی گازی جوجه های گوشتی با تغذیه رژیم غذایی با مکمل فیتازی

Performance, litter quality and gaseous odour emissions of broilers fed phytase supplemented diets

Abstract

The effect of graded levels of phytase on performance, bone characteristics, excreta/litter quality and odorant emissions was examined using 720 Ross 308 male d-old broilers. A 2 × 4 factorial arrangement of treatments was employed with 6 replicates of 15 birds per pen. Factors were: diets-positive and negative control (PC, NC); phytase – 0, 500, 1,000, 1,500 FTU/kg. The PC was formulated to meet the 2014 Ross 308 nutrient specifications, whereas the NC was formulated with lower Ca (−1.4 g/kg), available P (−1.5 g/kg), Na (−0.3 g/kg), dLys (−0.2 g/kg) and MEn (−0.28 MJ/kg) equivalent to nutrient matrix values for 500 FTU/kg phytase in the starter, grower and finisher periods (i.e., downspec diet). On d 24, phytase decreased FCR by 1.6, 4.3 and 4.6 points at inclusion levels of 500, 1,000 and 1,500 FTU/kg, respectively (P < 0.01) across all diets. Phytase by diet interactions on BW gain were observed on d 24 and 35 (P < 0.01). The effect of phytase was much more pronounced in the NC diet as compared with the PC diet. On d 24, phytase increased BW gain by 37, 55 and 68 g in the PC and 127, 233 and 173 g in the NC at 500, 1,000 and 1,500 FTU/kg, respectively. Diet by phytase interactions were also observed for tibia ash, litter quality and water to feed intake ratio (P < 0.01) with higher phytase effect in NC as compared with PC. Neither diet nor phytase impacted excreta moisture content on d 18 or 21 (P > 0.05). Solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS) analysis of gaseous emissions on d 39 indicated no difference in the emission of alcohols, aldehydes, ketones, volatile fatty acids and phenols between treatments (P > 0.05). The results indicate that phytase has greater benefits when formulated using nutrient matrix values as compared with adding it over the top in an already nutrient sufficient diet. The later method would be expected to increase feed costs without concomitant performance benefits.

1 Introduction

Phytase is commonly used in broiler diets to degrade the phytate content, thus eliminating its anti-nutritional effects, which include reduced nutrient digestion, increased endogenous losses of nutrients and decreased performance (Woyengo and Nyachoti, 2013). The degradation of phytate at ileal or total tract level has been shown to be incomplete at the standard 500 FTU/kg inclusion rate of phytase (Selle and Ravindran, 2007). Phytase at higher levels produces extra-phosphoric effects in broilers, such as improved energy, amino acid and P digestibility (Amerah et al., 2014; Cowieson et al., 2011), and enhanced growth and feed efficiency (Walk et al., 2014). A recent study showed improvements in litter quality with higher doses of phytase (Bedford and Walk, 2015), although some reports suggest that phytase is associated with wet litter (Debicki-Garnier and Hruby, 2003; Bedford et al., 2012). Phytase may increase water consumption and contribute to wet droppings when formulated into diets without using nutrient matrix values. Phytase is normally assigned nutrient matrix values for amino acids/protein and energy in addition to Ca and P to incorporate it into least cost formulations (Shelton et al., 2004). The level of Na in basal diets and Na matrix for phytase are often overlooked during formulation. High dietary Na and/or Ca levels may trigger increased water consumption and hence diuresis and wet litter (Collett, 2012). Phytase added at higher rates without lowering dietary Na and/or Ca may consequently affect litter quality.

Wet litter and odour issues from poultry farms have become prominent worldwide. It is important to maintain litter quality to promote bird health and welfare and to minimize odour emissions. Litter quality may deteriorate due to increased excretion of minerals by birds (van der Hoeven-Hangoor et al., 2013). Phytate can bind with minerals and protein in the diet making them unavailable for digestion (Cowieson et al., 2006; Selle et al., 2012). Phytase may therefore potentially improve litter quality by increasing the bioavailability of minerals and protein. Excreta/litter quality is generally measured by water activity, moisture and free water contents (van der Hoeven-Hangoor et al., 2014). The amount of water in the litter has been found to affect microbial activity (Himathongkham et al., 1999; Wadud et al., 2012), ammonia emissions (Miles et al., 2011) and odorant emissions (Sharma et al., 2016). It is, therefore, important to study the effect of phytase on litter quality and odour emissions together with performance, especially when used at higher levels. The aim of this study was to investigate the effects of graded levels of phytase in nutritionally adequate and downspec wheat based broiler diets on performance, excreta/litter quality and odour emissions.

مقالات انگلیسی و ترجمه های فارسی رایگان با فرمت PDF آماده دانلود رایگان میباشند

همچنین ترجمه مقاله با فرمت ورد نیز قابل خریداری و دانلود میباشد

مقاله انگلیسی رایگان (PDF)

ترجمه فارسی رایگان (PDF)

خرید ترجمه با فرمت ورد

فهرست مقاله:

چکیده

مقدمه

مواد و روش ها

جمع آوری و تهیه نمونه

تهیه عصاره( آلی/آبی) نرکیبی خیار دریایی

مطالعات شیمیایی

تحلیل ترکیبات متابولیک

تحلیل کروماتوگرافیک مایع با کارایی بالا

مطالعات بیوشیمیایی

حیوانات

تهیه و تجویز عصاره ترکیبی خیار دریایی

القای شیمیایی ازمایشی فیبروز کبدی

طرح مطالعه

جمع آوری و نمونه برداری خون و برخی اندام های بدن

تهیه هموژنات کبد

تست های بیوشیمیایی

تست های آنزیمی

مطالعات بافت شناسی

مطالعات آنتی اکسیدانی برون تنی

تحلیل آماری

نتایج

ترکیبات متابولیک و فنولیک در عصاره خیار دریایی

اثرات عصاره های خیار دریایی یا TAA بر روی وزن بدن، اوزان برخی از اندام ها و نرخ بقا

اثرات عصاره خیار دریایی یا تیو استامید بر روی تست های عملکرد کبد

بررسی بافتی

فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره خیار دریایی

بحث

نتیجه گیری

بخشی از ترجمه فارسی مقاله:

 مقدمه
خیار دریایی(Holothuria) یک بی مهره دریایی از شاخه خارپوستان و رده هولوتوریدا می باشد که در بستر دریا های جهان یافت می شود(1). بیش از 1000 گونه خیار دریایی وجود دارد و تقریبا 20 گونه از آن ها خوراکی هستند. خیار دریایی یک غذای لذیذ در چین و کشور های آسیایی می باشد. خیار دریایی، علاوه بر مزه و طعم خوب، عمدتا برای درمان زخم ها، اگزما، ورم مفاصل، فشار خون بالا، و ناتوانی جنسی (2-3) استفاده می شود. خیار دریایی یک غذای سالم است زیرا حاوی مواد فعال فیزیولوژیکی از جمله ویتامین ها (A، C، B1، B2، B3 و)، عناصر کمیاب (کلسیم، آهن، منیزیم و روی)، پلی ساکارید (سولفات کندرویتین) و گلیکوزیدهای ماده موثره ساپونین (4) می باشد. به علاوه برخی ترکیبات فعال زیستی استخراج شده از هولوتریان ها دارای فعالیت های ضد التهابی(5)، ضد تومور(6) و قارچ کش می باشند(7). بیشتر مطالعات بر روی خیار دریایی دریای سرخ (H. atra)، به صورت تاکسونومیکی بوده اند(8-10).
استرس اکسیداتیو نقش مهمی درآسیب کبدی (11) ایفا می کند. توجه اخیر به فنولیک های غذایی به دلیل نقش آن ها به عنوان آنتی اکسیدان ها و تنظیف کننده های گونه های اکسیژن واکنشی و رادیکال های آزاد و نیز نقش آن ها در پیش گیری از بسیاری از بیماری های پاتولوژیک نظیر بیماری های قلبی و کبدی(12) افزایش یافته است. هم چنین، ترکیبات فنولیک موجب افزایش مکانیسم های دفاعی درون زا شده، عناصر پاسخ آنتی اکسیدانی که تنظیم کننده بیان ژن آنزیم های دخیل در متابولیسم مرحله دوم زنوبیوتیک ها و دفاع آنتی اکسیدانی است را تحریک کرده و در عین حال اثرات بازدارندگی بر روی پروکسیداسیون لیپید غشا نشان می دهند(13).
هدف مطالعه حاضر شناسایی ترکیبات فنولیک فعال زیستی در عصاره ترکیبی دیواره بدنی H. atra و ارزیابی پتانسیل حفاظت کبدی آن در برابر فیبروز کبدی ناشی از تیو استامید TAA در موش های صحرایی می باشد. هدف دیگر این مطالعه تعیین اثر بخشی و کارایی انتی اکسیدانی عصاره ها در سیستم های بدون سلول می باشد.
مواد و روش ها
جمع آوری و تهیه نمونه
خیار دریایی صید شده از دریای سرخ( غردقه: شهری در کرانه مصر) توسط دکتر محمد زکی( آزمایشگاه بیو شیمیی دریایی، موسسه ملی شیلات و اقیانوس شناسی، شعبه خلیج عقبه و سوئز) برای این مطالعه اهدا شد. حیوانات به ازمایشگاه در جعبه های یخ حاوی مکعب یخ با کمی نمک سفره انتقال داده شدند. حیوانات فورا با آب مقطر شسته شده و تشریح شدند و همه اندام های احشایی آن ها خارج شد. کلیه اندام های داخلی یا سیالات بدنی شسته شده و سپس دیواره های بدنی این حیوانات در دمای-20 درجه تا زمان فراوری ذخیره شدند.
تهیه عصاره( آلی/آبی) نرکیبی خیار دریایی
روش استخراج در این مطالعه از مقاله هاک و همکاران(14) با اندکی اصلاحات اقتباس شد. دیواره های بدنی خیار های دریایی به قطعات کوچک بریده شده و در یک مخلوط کن خرد شده و سپس درون پتری دیش ریخته شد. پتری دیش ها به طور دقیق توزین شده و در یک آون در دمای 70 درجه به مدت 18 تا 20 ساعت قرار داده شدند تا زمانی که تغییری در وزن مشاهده نشد. نمونه های خشک شده با هاون تا زمان تولید پودر ریز ترکیب شدند. وزن پودر ریز در 10 حجم از ترکیب است و نیتریل و 0.1 درصد تری فلور استیک اسید در نسبت 60:40 معلق شده و به طور پیوسته به مدت 24 ساعت با استفاده از یک هم زن مغناطیسی هم زده شد. عصاره در 3000 دور بر دقیقه به مدت بیست دقیقه سانتریفیوژ شده و سوپر ناتانت وارد فلاسک خشک شده و در دمای 40 درجه حفظ شد. عصاره گیری دو بار بر روی باقی مانده ها تکرار شده و سوپرناتانت ها ترکیب شدند. عصاره ترکیبی در دمای 4 درجه به مدت 24 ساعت حفظ شد تا زمانی که حلال آلی به طور کامل تبخیر شده و سپس در دمای -50 درجه به مدت 36 ساعت تحت انجماد خشک قرار گرفت.

بخشی از مقاله انگلیسی:

Introduction

The sea cucumber (Holothuria) is a marine invertebrate of the phylum Echinoderm and the class Holothuroidea found on the sea floor worldwide [1]. There are more than 1000 species of sea cucumber, and approximately 20 are edible. Sea cucumber is a delicacy food in China and Asian countries. In addition to their good flavor, sea cucumbers are commonly used to treat wounds, eczema, arthritis, hypertension, and impotence [2,3]. The sea cucumber is a healthy food because it contains different physiologically active substances, including vitamins (A, C, B1, B2, and B3), trace elements (calcium, iron, magnesium, and zinc), polysaccharides (chondroitin sulfate), and saponin glycosides [4]. Furthermore, some bioactive compounds extracted from holothurians have been reported to have anti-inflammatory [5], antitumor [6], and fungicidal[7] activities. Most studies on the sea cucumber of the Red Sea (H. atra) have been taxonomic [8–10]. Oxidative stress is known to play an important role in liver injury [11]. Recent interest in food phenolics has increased owing to their roles as antioxidants and scavengers of reactive oxygen species and free radicals and their implied role in the prevention  of many pathologic diseases, such as heart and liver diseases [12]. Alternatively, phenolic compounds have been found to increase endogenous defense mechanisms, stimulate the antioxidant response element that regulates the gene expression of enzymes involved in phase II metabolism of xenobiotics and antioxidant defense, and exhibit inhibitory effects on membrane lipid peroxidation [13]. The present study was undertaken to identify the bioactive phenolic compounds in the H. atra body wall mixed extract and to evaluate its hepatoprotective potential against thioacetamide (TAA)-induced liver fibrosis in rats. The aim of the study was extended to determine the antioxidant efficacy of the extract in cell-free systems.

Materials and methods

Sample collection and preparation

Sea cucumbers (H. atra) caught from the Red Sea (Hurghada) were kindly provided by Dr. Mohamed Zaki (Laboratory of Marine Biochemistry, National Institute of Oceanography and Fisheries, Suez and Aqaba Gulfs branch). The animals were transported to our laboratory in an ice box containing ice cubes and a few pinches of table salt. The animals were immediately washed under running tap water and cut open, and all visceral organs were removed. The animals were rinsed thoroughly of any internal organs or body fluids, and then the body walls of the animals were stored at 20C until processing.

Preparation of sea cucumber mixed (organic/aqueous) extract

The adopted extraction technique was previously described by Haug et al. [14], with slight modifications. The body walls of the animals were cut into small parts, finely ground in a blender, and then poured in Petri dishes. The Petri dishes were precisely weighed and placed in an oven at 70C for 18 to 20 h until no change in weight was recorded. The dried samples were blended further with a pestle until a fine powder was produced. The weight of the fine powder was suspended in 10 vol of a mixture of acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid at a proportion of 60:40 (v/v) and stirred continuously in the dark for 24 h using a magnetic stirrer. The extract was centrifuged at 3000 rpm for 20 min and the supernatant was aspirated into a dry flask and kept at 4C. The extraction was repeated twice on the residue and the supernatants were combined. The mixed extract was kept at 4C for 24 h until the organic solvent was completely evaporated and then freeze-dried at 50C for 36 h.