دانلود رایگان ترجمه مقاله تولید پروتئین دگرسان در زیست لایه های اشرشیا کولی (نشریه الزویر ۲۰۱۷)

تولید پروتئین دگرسان در زیست لایه های اشرشیا کولی: یک فرم متداول کشت چگالی سلول بالا

Heterologous protein production in Escherichia coli biofilms: A non-conventional form of high cell density cultivation

چکیده
۱-مقدمه
۲-منابع و روشها
۲-۱ صفت موروثی باکتریایی، پلاسمیدها و شرایط کشت
۲-۲ سیستم تشکیل زیست لایه و نمونه برداری
۲-۳ روشهای تحلیلی
۲-۴ بیان پروتئین دگرسان
۲-۶ تحلیل آماری
۳- نتایج
۴- بحث
۵- نتیجه گیری

چکیده

اشرشیا کولی، یکی از میزبانان مساعد برای تولید پروتئین دارای صفات ارثی جدید است و به صورت یک مدل عالی برای مطالعات زیست لایه شناخته میشود. کشتهای چگالی سلول بالای (HCDC) این باکتری، بازده های تولید حجمی جذابی را میسر میسازند و سلولهایی که در زیست لایه رشد می یابند در برخی چالشهای کشتهای پلانکتونی چگالی بالای سلول دخیل هستند.
این اثر، پتانسیل تولید سلولهای زیست لایه E.coli JM109 (DE3) را ارزیابی میکنند که یک پروتئین الگو را بیان میکنند، پروتئین فلوئورسان سبز ارتقا یافته (eGFP )، از یک پلاسمید دارای صفات ارثی متشکل جدید. یک صفت موروثی پرورش دهنده ی تیره ی پلاسمیدی یکسان اما دچار کمبود ژن eGFP برای ارزیابی اثر تولید پروتئین دگرسان بر تشکیل زیست لایه بکار رفت. نتایج نشان میدهد تولید eGFP از سلولهای زیست لایه در حدود ۳۰ برابر بالاتر از حالت پلانکتونی بود. به علاوه، سلولهای بیان کننده ی eGFP ، تشکیل زیست لایه را در مقایسه با سلولهای کنترل ارتقا داده بودند. مقادیر تولید حجمی، دو برابر مقادیر قبلا گزارش شده با همان پروتئین بود و در طیف چیزی هستند که میتواند با HCDC در تولید پروتئینهای حلال بدست آید. گرچه چگالی بالای سلولی که بدست آمد از HCDC متداول پایین تر بود (۰٫۵ برابر)، این سیستم نوین به مقادیر تولید خوبی دست یافت که احتمالا پس از بهینه سازی شرایط کشت، بهبود می یابند.
۱- مقدمه
باکتری گیاهی گرم-منفی اشرشیا کولی، یک میزبان ارجح برای تولید پروتئینهای دارای صفات ارثی متشکل جدید محسوب میگردد که به خاطر رشد سریع آن در چگالی های بالای سلولی، شرایط مورد نیاز غذایی ساده، ژنتیک کاملا شناخته شده و دسترسی به شمار زیادی از حاملهای تولید مثل غیر جنسی و صفات موروثی میزبان جهش یافته است. این باکتری گیاهی دارای توانایی انباشته کردن بسیاری از پروتئینهای دارای صفات ارثی متشکل به حداقل ۲۰% از پروتئین سلولی کل میباشد و در پاره ای از موارد، آنها را از سیتوپلاسم به پریپلاسم منتقل میکند. کشت ای.کولی در پرورشهای چگالی بالای سلول (HCDC)، مزایای زیادی را ارائه میدهد همانند حجم کشت کاهش یافته، فراوری پایین دست ارتقا یافته و هزینه های تولید پایین تر. با وجود این مزایا، هنوز هم چالشهای زیادی وجود دارد که باید در HCDC مورد بررسی قرار گیرند و آنها عبارتند از انتقال اکسیژن ناکافی، شرایط لازم محیط کشت ویژه، بازده ترکیب کاهش یافته در راکتور، تجمع کربن دی اکسید که مقادیر رشد تولید استات بیشتر را کاهش میدهند. تولید پروتئین دارای صفات ارثی متشکل جدید توسط سلولهای زیست لایه در برخی از چالشهای HCDC متداول بویژه پخش مواد مغذی و اکسیژن از طریق زیست لایه و هم چنین در انباشتن تولیدات ضایعات سمی دخیل است.
بیان پروتئین دارای صفات ارثی متشکل جدید در زیست لایه های ای.کولی توسط هوآنگ و همکارانش پیشتاز شد که تولید بتا-گالاکتوسیداز را در E.coli DH5a حامل یک پلاسمید حاوی ترویج دهنده ی tac بررسی کرده اند. بعدها، اُکونل و همکارانش، نخستین سیستم برای تولید پروتئین دگرسان سطح بالا را در سلولهای زیست لایه ای.کولی با استفاده از یک حامل مبتنی بر pUC برای بیان پروتئین فلوئورسان سبز ارتقا یافته (e.GFP) توصیف نموده اند. با وجود پتانسیل عظیم این سیستم بیان کننده، تولید پروتئین دگرسان از سلولهای زیست لایه ای.کولی به طور وسیعی بررسی نشده باقی می ماند.
۵- نتیجه گیری
استفاده از سلولهای ای.کولی در HCDC یک شیوه ی بسیار جذاب تولید پروتئینهای دگرسان از طریق بهبود بهره وری های حجمی و کاهش سرمایه گذاری پولی و هزینه های عملیات در تاسیسات تولید است. تولید پروتئینهای دگرسان در سلولهای زیست لایه در بخشی از چالشهای HCDC دخیل است اما برخی مطالعات نشان داده اند سلولهای زیست لایه از یک ظرفیت تولید ویژه عالی برخوردارند زمانیکه با همتاهای پلانکتونی خود مقایسه میشوند. این اثر نشان میدهد سلولهای زیست لایه ای.کولی میتوانند یک پروتئین دگرسان الگو را در مقادیر بسیار بالاتر از سلولهای پلانکتونی تولید کنند و چگالی های سلولی و بهره وری های حجمی از قبل در طیف چیزی هستند که میتوانند توسط HCDC بدست آیند حتی بدون بهینه سازی شرایط کشت. اثر آینده، بهینه سازی این شرایط را برای مهار قدرت این زیست لایه های تولید کننده بررسی خواهد کرد.

Abstract

Escherichia coli is one of the favourite hosts for recombinant protein production and is recognized as an excellent model for biofilm studies. High cell density cultures (HCDC) of this bacterium enable attractive volumetric production yields and cells growing in biofilms share some of the challenges of conventional high cell density planktonic cultures. This work assesses the production potential of E. coli JM109(DE3) biofilm cells expressing a model protein, the enhanced green fluorescent protein (eGFP), from a recombinant plasmid. A control strain harbouring the same plasmid backbone but lacking the eGFP gene was used to assess the impact of heterologous protein production on biofilm formation. Results show that specific eGFP production from biofilm cells was about 30 fold higher than in planktonic state. Moreover, eGFP-expressing cells had enhanced biofilm formation compared to control cells. Volumetric production values were 2 fold higher than those previously reported with the same protein and are within the range of what can be obtained by conventional HCDC in the production of soluble proteins. Although the cellular density that was obtained was lower than in conventional HCDC (0.5 fold), this novel system reached good production values which are likely to be improved after optimization of culture conditions.

۱- Introduction

The Gram-negative bacterium Escherichia coli is a preferred host for the production of recombinant proteins [1,2] due to its fast growth at high cell densities, simple nutrient requirements, well-known genetics and the availability of a large number of cloning vectors and mutant host strains [3]. This bacterium has the ability to accumulate many recombinant proteins to at least 20% of the total cell protein [4] and, in some cases, to translocate them from the cytoplasm to the periplasm [5]. E. coli cultivation in high cell density cultures (HCDC) presents many advantages such as reduced culture volume, enhanced downstream processing and lower production costs [6]. Despite these advantages, there are still many challenges that have to be addressed in HCDC and these include insufficient oxygen transfer, specific culture medium requirements, reduced mixing efficiency in the reactor, accumulation of carbon dioxide which decreases growth rates and increased acetate production [5,6]. Recombinant protein production by biofilm cells shares some of the challenges of conventional HCDC, namely in diffusion of nutrients and oxygen through the biofilm and also in the accumulation of toxic waste products [7,8]. Recombinant protein expression in E. coli biofilms was pioneered by Huang et al. [9- 11] who have studied the production of -galactosidase in E. coli DH5α carrying a plasmid containing the tac promoter. Later, O’Connell et al. [12] have described the first system for high level heterologous protein production in E. coli biofilm cells using a pUC-based vector for the expression of enhanced green fluorescent protein (eGFP). Despite the enormous potential of this expressing system, heterologous protein production from E. coli biofilm cells remains largely unexplored.

۵ -Conclusions

Using E. coli cells in HCDC is a very attractive way of producing heterologous proteins by improving volumetric productivities and reducing capital investment and operation costs in production facilities. Producing heterologous proteins in biofilm cells shares some of the challenges of HCDC, but some studies have shown that biofilm cells have a superior specific producing capacity when compared to their planktonic counterparts. This work shows that E. coli biofilm cells can produce a model heterologous protein at much higher levels than planktonic cells and that the cellular densities and volumetric productivities are already within the range of what can be obtained by HCDC, even without optimization of culture conditions. Future work will address the optimization of these conditions in order to harness the power of these productive biofilms..