دانلود رایگان ترجمه مقاله نحوه سنتز نانوذرات کیتوزان-آلژینات-STPP (Dovepress سال 2017)

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

تست های کشت سلولی
برای ارزیابی جذب سلولی کورکومین، سلول های سرطانی HeLa از موسسه پاسچر تهران، ایران خریداری شد. سلولها در محیط موسوم به Roswell Park Memorial ( شهری در نیو مکزیکو) با 10٪ سرم جنین گاوی و 1٪ پنی سیلین / استرپتومایسین در 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور CO2 کشت داده شدند. سلول ها با غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر آزاد کورکومین یا بارگیری و ترکیب شدند. پس از 24 ساعت، سلولهای مورد آزمایش با PBS شسته شدند و سپس تحت میکروسکوپ فلورسانس معکوس بررسی شدند. (ابزار نیکون، ملویل، نیویورک، ایالات متحده آمریکا). به منظور ارزيابي اثرات سيتوتوكسيك نيتروژن كركومين، فيبروبلاست هاي فوربك پوست انسان و سلول هاي HeLa با تراكم 103 × 7 ميكروليتر در صفحات 96 كيلويي بذر كشت داده شدند و با غلظت هاي متفاوت كركومين آزاد و كپسول شده به مدت 48 ساعت انكوبه شدند. سپس (MTT 5 میلی گرم بر میلی لیتر) به هر چاه اضافه شد و سلول ها در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 4 ساعت انکوباتور شدند. برای حل شدن رسوب فرانسان آبی، دی متیل سولفوکسید اضافه شد و جذب در 570 نانومتر توسط یک ارزیابی کننده ELISA (BioTek، Winooski، VT، USA) تعیین شد. 

رنگ آمیزی هسته ای
همانند آزمایش MTT، سلول از خط سلولی HeLa کشت شدند و به مدت 48 ساعت با NP خالص، کورکومین یا NPC های کورکومین انکوباتور شدند. سپس، سلول ها با PBS شسته شدند و با پروما فرمالدئید 4٪ ثابت به مدت 20 دقیقه ثابت می شدند. پس از شستشو با PBS، برای افزایش نفوذ پذیری، 0.2٪ Triton X-100 به مدت 20 دقیقه اضافه شد؛ در مرحله نهایی، رنگ آمیزی هسته ای به مدت 25 دقیقه با استفاده از DAPI (1 میکروگرم در میلی لیتر سانتا کروز بیوتکنولوژی، سانتا کروز، CA، USA) انجام شد و سلول ها تحت یک میکروسکوپ فلورسنت (نیکون) مشاهده شدند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی کمی (qRT-PCR)
سلول های HeLa به مدت 48 ساعت با NP های خالی، کورکومین و CF-ALG-STPP NPC (50 میکروگرم بر میلی لیتر) کورکومین انکوباتور شدند. سپس آنها با PBS شسته شدند و RNA با استفاده از کل کیت استخراج RNAیکتا تاجیز، تهران، ایران) بر اساس پروتکل تولید کننده استخراج شد. سنتز cDNA با استفاده از کیت رونویسی شده معکوس تجاری (یکتا تاجیز) انجام شد. در مجموع 20 میکرولیتر مخلوط واکنش حاوی 4/0 میکروگرم پرایمر جلو، 0.4 میکروگرم مبدل برگشتی، 2 میلی لیتر cDNA، 10 میکرو لیتر SYBR سبز PCR ترکیبی اصلی(یکتا تاجیز)، 0.4 میکرولیتر کربوکسی-ادرادامین (یکتا تاجیز) و 6.8 میلی لیتر RNase آب آزاد GAPDH به عنوان یک کنترل داخلی مورد استفاده قرار گرفت. سطح ویژگی ژن با روش Ct تجزیه و تحلیل شد. جدول S1 توالی پرایمر و دمای آنیلینگ را نشان می دهد.

تحلیل آماری
داده های آزمون MTT با استفاده از آزمون آماری t مستقل تجزیه و تحلیل شد. نتایج qRT-PCR با استفاده از تجزیه واریانس یک طرفه و سپس پس آزمون توکی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتايج به صورت ميانگين ± خطاي استاندارد ميانگين و p-value 0.05 به صورت آماري معني دار در نظر گرفته شدند.

نتایج
خواص نانوذرات CS -ALG -STPP NPC حاوی کورکومین
نتایج FE-SEM نشان داد که NP-CFC-ALG-STPP دارای کورکومین کروی و اندازه متوسط ~ 50 نانومتر است که با یکدیگر جمع و متراکم می شوند (شکل 1A. ). شکل 1B یک تصویر AFM و نمای سه بعدی آن را نمایش می دهد. مطابق با داده های FE-SEM، اندازه گیری نتایج AFM نیز نشان می دهد که ذرات دارای توزیع اندازه یکنواخت هستند و اندازه های متوسط نانوذرات کورکومین بارگذاری شده 50 نانومتر است (شکل 1C.)

تجزیه و تحلیل طیف سنجی FT-IR
شکل 2 طیف های FT-IR از کورکومین، CS-ALG-STPP و NC-ALG-STPP ترکیب شده کورکومین را نشان می دهد. در طیف نانوذرات CS-ALG-STPP، گروه وسیعی در 3،432 cm-1 به گروه هیدروکسیل و آمین مربوط می شود.

رئوس یا پیکهای نزدیک به 1630 و 1413 سانتیمتر مربع به ارتعاشات متقارن و نامتقارن کششی گروه های COO اختصاص یافته است. علاوه بر این، باند حدود 1،026 cm-1 متعلق به باندهای آمید است. اوج 1،087 cm-1 به علت وجود -CH-OH در الکل سیلیکونی و کشش C-O است. برای کورکومین، پیک در 3،478 سانتیمتر 1 مربوط به گروه های آمین است. پیک جذب در 1510 سانتیمتر مشاهده می شود که مربوط به ارتعاشات C = O و C = C کورکومین است.
علاوه بر این، پیک جذب برای باندهای دوگانه C = C در 1 627 cm-1 در این طیف به دلیل همپوشانی با اوج CS-ALG-STPP واضح نیست. شدت اوج نسبی نانوذراتCFC-ALG-STPP کورکومین کمی ضعیف است، که ممکن است به دلیل وابستگی کورکومین به گروههای کاربردی ماتریس CS-ALG باشد.

راندمان جذب
برای ارزیابی کارایی انکپسولاسيون، تجزیه HPLC بر روی محلول ریخته شده، محلول پس از شستشو با اتانول و مخلوط نانوذراتCS-ALG-STPP کرکومین در آب انجام شد. با محاسبه منطقه زیر پیک، بازده نهایی برای آماده سازی NP حدود 70٪ بود (شکل 3).

انتشار کورکومین در محیط آزمایشگاهی از CS -ALG -STPP NP
مشخصات آزمایشی دارو در یک زمان معین مورد بررسی قرار گرفت و درصد کورکومین آزاد شده از NP-CS-ALG-STPP با استفاده از منحنی استاندارد اندازه گیری شد. شکل 4 آزمایشی آزمایشی داروی NPc کرکومین را نشان می دهد. داده های ما نشان داد که 24٪ و 29٪ از کورکومین پس از 1 و 2 ساعت از NP ها ، به ترتیب آزاد می شوند. سپس، رهاسازی کنترل شده شديد تا 24 ساعت مشاهده شد و 53٪ از کورکومين بارور شده فيزيکي در اين دوره آزاد شد (شکل 4).

جذب کورکومین و نانوذرات CS -ALG -STPP
فرایند ایزوترم برای ارزیابی ظرفیت بارگیری کورکومین بر روی NP-CS-ALG-STPP انجام شد. شکل 5، ایزوترم جذب برای کورکومین و NP-CS-ALG-STPP را نشان می دهد. نتایج تجربی مناسب با معادلات ایزوترم لانگمویار، فروندلیچ، تمکین، الوویچ و لانگمویر فروندلیچ بودند. جدول 1 داده های ایزوترم جذب برای کورکومین را در NP-CS-ALG-STPP و پارامترهای تعادلی نشان می دهد. تجزیه و تحلیل رگرسیون نشان داد که در بین ایزوترم های ذکر شده، مدل ایزوترم لانگموری-فروندلیچ بیشترین خطی بودن را نشان می دهد (R2 = 992).

آزمایشات درون آزمایشگاهی
بر اساس فعالیت فلورسانس ذاتی کورکومین، جذب آن در سلول های HeLa، 48 ساعت پس از انکوباسیون NPC-ALG-STPP NPC کورکومین مورد بررسی قرار گرفت. تصاویر میکروسکوپی فلورسنس نشان داد که سلول های کنترل و آنهایی که با NP-CS-ALG-STPP انکوباتور به عنوان گروه آزمایشی خالی نانوذرات هیچ فعالیت فلورسانس نشان نمی دهد. در مقایسه با گروه های آزمایشی کنترل و خالی ناقل NP ، سلول های HeLa که با آزاد کورکومین یا NPC کروکومین (50 میکروگرم بر میلی لیتر) تحت درمان با فلورسانس سبز قرار گرفته اند (شکل 6A). در مرحله بعد، اثر سیتوتوکسی NPs کرکومین بارگذاری شده با استفاده از آزمون MTT ارزیابی شد. فیبروبلاست های پیش پوست انسان و سلول های HeLa به مدت 48 ساعت با دوزهای مختلف کربوکامین آزاد یا کورکومین بارگذاری نشده CS-ALG-STPP NP (6.25، 12.5، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلی لیتر) انکوباتور شدند. برای ارزیابی سمیت نارسایی های کورکومین بر روی سلول های طبیعی، فیبروبلاست های فورنچه پوست انسان کشت شدند و با غلظت های مختلف کورکومین نانوذرات ترکیبی با کورکومین به مدت 48 ساعت انکوباتور شدند. نتایج حاصل از MTT نشان داد که اثر سیتوتوکسیک قابل توجه در درمان سلول های کروموزوم طبیعی تحت درمان با نانوذرات کورکومین یا نانوذرات ترکیبی با کورکومین (شکل 6B) مشخص نشد. علاوه بر این، اثر سیتوتوکسی NP در بیماران مبتلا به سرطان HeLa مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آزمون زنده ماندن سلول نشان می دهد که NPs کرکومین بارگذاری شده، به ویژه دوز بالای آن ، اثر بازدارنده وابسته به دوز ، به تکثیر سلولی نسبت به گروه کوروکوم آزاد داشت (شکل 6B).