رابطه بین مصرف اسپرین با بقا پس از سیستکتومی رادیکال

The Association of Aspirin Use with Survival Following Radical Cystectomy

چکیده
مقدمه
روش
جمعیت مورد مطالعه
تشخیص حساسیت
شاخص های برایند
تحلیل آماری
نتایج
بحث
نتیجه گیری

چکیده
هدف: آسپرین ممکن است از طریق مهار سیتوکین های التهابی که باعث تنظیم پرولیفراسیون سلولی، آنژیوژنز و آپوپتوز می شود، دارای خواص ضدویروسی باشد. در بیماران مبتلا به سرطان مثانه غیر تهاجمی، آسپیرین با کاهش خطر ابتلا به عود همراه است. ما ارتباط آسپیرین با بقا را با استفاده از سیتکتومی رادیکال بررسی کردیم.
مواد و روشها: در مجموع، 1061 بیمار در سالهای 2007 و 2016 در موسسه ما با سیتیکتومی رادیکال تحت عمل جراحی قرار گرفتند که 461 نفر (43٪) از آنها در زمان عمل جراحی آسپرین بودند. برآوردهای بقا با روش کاپلان-مایر سنجیده شد. مدل خطرات متناسب Cox برای بررسی ارتباط بین ویژگی های بیمار و بقا استفاده شد.
يافته ها: پيگيري متوسط پس از سيستکتومی راديکال در بين بازماندگان 4/2 سال بود (IQR 2e6،2). در طول این زمان 442 بیمار مرد، از جمله 331 مورد سرطان مثانه. مصرف کنندگان آسپیرین به طور قابل توجهی مسن تر، احتمالا سابقه بیماری قلبی عروقی و دیابت و بیشتر احتمال دارد که از متفورمین یا استاتین استفاده کنند (هرکدام از اینها p <0.05). با این وجود، ما دریافتیم که بیماران مصرف کننده آسپرین روزانه بطور معنی داری بیشتر از بقیه 5 ساله سرطان خاص (68٪ در مقابل 60٪، 02/0 p ¼ و بقاء کل (59٪ در برابر 52٪، P = 0.03) نسبت به افراد غیرمستقیم بیشتر بود. علاوه بر این، پس از تعدیل متغیر، مصرف آسپیرین به طور مستقل همراه با مرگ و میر ناشی از سرطان کمتر (HR 0.64، 95٪ CI 0.45e0.89، p ¼ 0.01) و همچنین علت مرگ و میر (HR 0.70، 95٪ CI 0.53e0.93، p ¼ 0.02) اما با متاستاز دوردست (p> 0.05).
نتيجه گيري: مصرف روزانه آسپيرين با نتايج بيهوشي راديكال به طور قابل توجهي بهبود يافته است. تحقیقات بیشتری برای ارزیابی پتانسیل زیربنایی مکانیسم های بیولوژیکی و بررسی علیت لازم می باشد.
.
1. مقدمه
آسپرین ممکن است دارای خواص آنتی نئوپلاستیک از طریق تنظیم کاهشی سیتوکین های التهابی باشد که این موضوع منجر به کاهش تکثیر سلول، آنژیوژنز و بهبود آپوپتوز می شود. در واقع، همبستگی بین استفاده روزانه از اسپرین و کاهش مرگ و میر ناشی از سرطان برای سرطان های کلورکتال، پروستات و سینه اثبات شده است. از حیث این داده ها، USPSTF امروزه توصیه کرده است تا از اسپرین دوز پایین در افراد 50 تا 59 سال با فاکتور ریسک قلبی عروقی برای پیشگیری اولیه نه تنها برای بیماری قلبی عروقی، بلکه برای سرطان کلورکتال استفاده شود.
داده های پیش بالینی نشان می دهد که آسپرین به عنوان یک مهار کننده غیر قابل برگشت COX ممکن است فعالیت در برابر سرطان های دهان و دندان داشته باشد. مطالعات در مدل های سرطان موش های مبتلا به سرطان پروستات نشان دهنده تنظیم مقررات ایزوفرم COX-2 در بافت تومور با افزایش همراه با تولید PGE2 است که به نظر می رسد پروکاریس سینژیک است. [16] علاوه بر این، در میان بیماران مبتلا به NMIBC با خطر بالا استفاده از آسپیرین BCG در داخل شکمی با کاهش خطر ابتلا به عود همراه است. 7/8 با این وجود، اهمیت آسپیرین در بیماران مبتلا به سرطان مثانه که تحت درمان با RC قرار گرفته اند، مشخص نشده است.
بنابراین، ما ارتباط بین مصرف روزانه آسپیرین و بقا را در بیماران RC مورد بررسی قرار دادیم.

Abstract

Purpose: Aspirin may have antineoplastic properties through the inhibition of inflammatory cytokines that regulate cell proliferation, angiogenesis and apoptosis. In patients with nonmuscle invasive bladder cancer aspirin use has been linked to a reduced risk of recurrence. We evaluated the association of aspirin with survival following radical cystectomy.

Materials and Methods: A total of 1,061 patients underwent radical cystectomy at our institution between 2007 and 2016, of whom 461 (43%) were aspirin users at the time of surgery. Survival estimates were assessed by the Kaplan-Meier method. The Cox proportional hazards model was applied to evaluate associations between patient features and survival.

Results: Median followup after radical cystectomy among survivors was 4.2 years (IQR 2e6.2). During this time 442 patients died, including 331 of bladder cancer. Aspirin users were significantly older, more likely to have a history of cardiovascular disease and diabetes, and more likely to use metformin or statin (each p <0.05). Nevertheless, we found that patients who ingested a daily aspirin had significantly higher 5-year cancer specific survival (68% vs 60%, p ¼ 0.02) and overall survival (59% vs 52%, p ¼ 0.03) compared to nonusers. Moreover, after multivariable adjustment aspirin use remained independently associated with lower cancer specific mortality (HR 0.64, 95% CI 0.45e0.89, p ¼ 0.01) as well as all cause mortality (HR 0.70, 95% CI 0.53e0.93, p ¼ 0.02) but not with distant metastasis (p >0.05).

Conclusions: Daily aspirin use was associated with significantly improved survival outcomes following radical cystectomy. Further research is warranted to evaluate the potential underlying biological mechanisms and investigate causality.

1. Introduction

ASPIRIN may have antineoplastic properties through the down-regulation of inflammatory cytokines, leading to decreased cell proliferation, reduced angiogenesis and apoptosis promotion.1 Indeed, an association between daily aspirin use and reduced cancer specific mortality has been demonstrated for colorectal, prostate and breast cancers.2e4 In light of these data the USPSTF (United States Preventive Services Task Force) currently recommends initiating low dose daily aspirin in adults 50 to 59 years old with cardiovascular risk factors for the primary prevention of not only cardiovascular disease but also colorectal cancer.5 However, the association between aspirin and outcomes in patients with bladder cancer remains to be defined.

Preclinical data suggest that aspirin as an irreversible COX inhibitor may have activity against urothelial cancer. Studies in rat urothelial cancer models have shown up-regulation of the COX-2 isoform in tumor tissue with an associated increase in the production of PGE2, which is thought to be procarcinogenic.1,6 Moreover, among patients with high risk NMIBC treated with intravesical BCG aspirin use has been linked to a reduced risk of recurrence.7,8 Nevertheless, the importance of aspirin in patients with bladder cancer who undergo RC has not been established.

Therefore, we evaluated the association between daily aspirin use and survival in patients who underwent RC.

رابطه بین مصرف اسپرین با بقا پس از سیستکتومی رادیکال

The Association of Aspirin Use with Survival Following Radical Cystectomy

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

این مطالعه یک سیستم شناسایی ارائه می کند که از CNN استفاده می کند تا بتواند حالت های غیر عادی در ماموگرافی ها را شناسای کرده و آن ها را تشخیص دهد. به صورت عمومی، یک ماموگرام به صورت نرمال، خوش خیم و یا بدخیم دسته بندی می شود (شکل 1 یک مثال را نشان میدهد).
دو گام آخر در شبکه های عمقی عصبی انجام می شود که هر دو قسمت استخراج ویژگی و دسته بندی آن ها را به صورت خودکار انجام می دهد. این مقاله به صورت زیر دسته بندی شده است. یک مرور نسبت به کار های مرتبط در بخش 2 ارائه شده است. بخش 2 روش ما برای پردازش داده ها را مطرح کرده و معماری CNN را نمایش می دهد. در بخش 4، ما نتایج کار خودمان را ارائه می کنیم. در نهایت، در بخش 5 نیز ما یک جمع بندی از مطالعه را همراه با مباحث عمومی نسبت به نتایج به دست آمده را ارائه می کنیم.

2. کارهای مرتبط
تمام زنان ممکن است تحت تاثیر سرطان پستان قرار بگیرند .سرطان پستان دلیل اول مرگ زنان می باشد. در نتیجه، مطالعه های مختلفی انجام شده است تا ابزاری توسعه پیدا کنند که بتوان از آن ها برای تشخیص این بیماری های سرطانی استفاده کرد. سیستم های شناسایی خودکار سرطان پستان با استفاده از تکنیک های مختلف یادگیری ماشینی (ML) توسعه پیدا کرده اند.
در سال 2008، ورما یک روش برای دسته بندی تصویر های ماموگرافی را ارائه کرد که به هدف شناسایی سرطان پستان مورد استفاده قرار می گرفت. روش پیشنهاد شده مبنی بر قرار دادن نورون های جدید در لایه های پنهان شبکه می باشد. نرخ دسته بندی در این روش 94% بود.
در سال 2016 سعید و همکارانش از تصویر های رزونانس مغناطیسی استفاده کردند تا ویژگی ها را برای دسته بندی تصویر های ماموگرافی در دو دسته، استخراج کنند: بدخیم، خوش خیم. آن ها در مطالعه خودشان از الگوریتم های KNN و LDA استفاده کردند.
همچنین در سال 2016، ژنگ و کی و همکارانش، از الگوریتم های یادگیری بدون سرپرست استفاده کردند: ماشین بلتزمن محدود (RBM) و ماشین بلتزمن با درگاه نقطه ای (PGBM) با استفاده از یادگیری عمقی در این مطالعه ها مورد استفاده قرار گرفت تا ویژگی های تصاویر برای دسته بندی سرطان پستان استخراج شود. صحت به دست آمده در این مطالعه ها 93.4% بود.
همچنین در سال 2016، سیدنی و لیما از دو نوع مختلف از داده ها یعنی تصاویر و بافت استفاده کردن تا بتوانند ویژگی های هر نوع از داده ها را با استفاده از لحظات زرنیک و موجک هایی با چند تفکیک به دست بیاورند. روش به دست آمده نتایج SVM و ELM را برای دسته بندی سرطان پستان با صحت 94.11% ترکیب می کند.

در سال 2017، الهرابی و تچیر یک سیستم خودکار را برای شناسایی کردن سرطان پستان ارائه کردن که مبتنی بر دیتابیس عربستان سعودی بود و نتایج الگوریتم های ژنتیک و فازی را با یکدیگر ترکیب کردند.
این روش ها که در قسمت بالا توصیف شدند نیازمند یک گام اساسی برای استخراج ویژگی های تصویر قبل از گام شناسایی می باشند و نمی توان به صورت زمان واقعی از آن ها استفاده کرد. بر اساس دانش ما، این کار اولین کار است که از شبکه های عصبی پیچه ای برای سیستم های تشخیص کامپیوتری استفاده می کند که برای سرطان پستان مورد استفاده قرار می گیرند. این کار، در ادامه وظایف قبلی انجام شده است.

3. روش پیشنهاد شده
ایجاد کردن شبکه ها با روش پیشنهاد شده که در شکل 2 نشان داده شده است، بعد از چند آزمایش و یک مطالعه دقیق نسبت به مقالات برای دیگر روش های دسته بندی، محقق شد. یک گام اولیه برای دسته بندی دستی در دیتابیس نیز برای به دست آوردن جرم های مختلف، انجام شد.

3.1. دسته بندی
در روش ما، یک دسته بندی دستی از جرم در بیس یادگیری (بیس ما شامل تصویر های جرمی می باشد که یک دایره قرمز دور آن ها کشیده شده است) انجام می شود تا بتوان کانتور ها را به دست آورد تا با استفاده از تحلیل ImageJ آن ها را تحلیل کرد( شکل 3 نشان دهنده یک نمونه می باشد).

3.2. معماری CNN و تشخیص آن
ما از 6 لایه در معماریCNN خودمان استفاده می کنیم که به صورت زیر سازمان دهی شده است: لایه پیچه ایCI، لایه نمونه برداری S1، لایه پیچه ای C2، لایه نمونه برداری S2، لایه متراکم D و در نهایت لایه خروجی O (شکل 2). پارامتر های اصلی این مدل و اطلاعات تمرین در معماری CNN پیشنهاد شده در شکل 4 توصیف شده اند.

مقالات انگلیسی و ترجمه های فارسی رایگان با فرمت PDF آماده دانلود رایگان میباشند

همچنین ترجمه مقاله با فرمت ورد نیز قابل خریداری و دانلود میباشد

مقاله انگلیسی رایگان (PDF)

ترجمه فارسی رایگان (PDF)

خرید ترجمه با فرمت ورد

فهرست مقاله:

چکیده
مقدمه
روش‌ها
نتایج
یافته‌های آندوسکوپی و بافت شناسی (جدول‌های 1 و 2)
بحث

بخشی از ترجمه فارسی مقاله:

مقدمه
سندرم سرطان کولورکتال وراثتی پولیپوز آدنوماتوز خانوادگی (FAP) در اثر جهش رگه زایشی در ژن آدنوماتوز پولیپوز کولی (APC) روی می‌دهد. علل اصلی سرطان در بیماران FAP شامل کولورکتال، دوازدهه و تیروئید هستند (1 و 2). دستورالعمل‌های متعدد، توصیه‌های مراقبتی را برای پیشگیری از این سرطان‌های مربوط به FAP بیان نموده‌اند (5-3).
سرطان معده به عنوان یک ریسک سلامتی در بیماران غربی FAP با ریسک مادام العمر 0.6 درصد مشابه با ریسک جمعیت کل مطرح نشده است (6). پولیپ های معده به طور متداول در مراقبت آندوسکوپی فوقانی برای پولیپوز دوازدهه دیده می‌شوند. متداول‌ترین ضایعات، پولیپ های غده فوندوس (FGP) هستند. Bianchi و همکاران FGP را در 88% از بیماران FAP، با دیسپلازی درجه پایین فوئولار در 38% و دیسپلازی درجه بالای فوئولار در 3% نشان دادند. عوامل مربوط به دیسپلازی فوئولار عبارتند از اندازهFGP، مرحله پولیپوز دوازدهه، ورم معده و عدم درمان سرکوبگر اسید (7).
ما افزایش ناگهانی بروز سرطان معده در بیماران FAP ثبت شده در فهرست سرطان کولون وراثتی و ویژگی‌های مرتبط دموگرافی، آندوسکوپی و بافت شناسی را در این بیماران گزارش می‌کنیم.
روش‌ها
767 بیمار با تشخیص بالینی یا ژنوتیپ پولیپوز آدنوماتوز خانوادگی (FAP) یا پولیپوز آدنوماتوز ضعیف خانوادگی (aFAP) که حداقل یک آندوسکوپی از دستگاه گوارش فوقانی داشتند، از طریق دیتابیس کلنن مورد تأیید IRB و مرکز ثبت سرطان کولورکتال موروثی دیوید جاگلمن در استفورد قابل دسترس بودند. بیماران با سرطان معده از طریق محقق و جستجوی پایگاه داده کلنن شناسایی شدند. از زمان ثبت نا زمان تشخیص، همه روش‌های مراقبت آندوسکوپی از جمله EGD، سونوگرافی آندوسکوپی، برش مخاطی آندوسکوپی و تشریح زیرمخاطی آندوسکوپی مرور شدند. اطلاعات به دست آمده عبارت بودند از مورفولوژی، محل، اندازه و بافت شناسی پولیپ. دوره پیگیری از زمان تشخیص تا مرگ یا زمان تشخیص تا نوامبر 2016 ادامه داشت.
برای محاسبات آماری، داده‌های پیوسته به صورت میانگین و دامنه بیان شدند. داده‌های مقوله‌ای به صورت اعداد خام و درصد یا نسبت بیان شدند. نرخ استاندارد بروز (SIR) به صورت نرخ موارد دیده شده سرطان معده به تعداد موارد موردانتظار طبق پایگاه داده SEER سرطان معده محاسبه شد.
نتایج
پرونده‌های پزشکی 767 بیمار FAP که از ژانویه 2001 تا نوامبر 2016 حداقل یک آندوسکوپی فوقانی داشتند، مرور شدند. از شروع ثبت در 1979 تا 2006 هیچ مورد آدنوکارسینوم معده دیده نشد. از 2012 تا 2016 نه مورد دیگر به طور کلی 767/10 (1.3%) شناسایی شدند که باعث نرخ استاندارد بروز 140 شد. همه موارد در بیماران با پولیپوز غده فوندوس و توده‌های پولیپ های معده در پروگزیمال از جمله فوندوس و بدن یافت شدند. میانگین سن در تشخیص سرطان 57 (75-35) سال بود و 6 نفر زن بودند.
میانگین بازه از کولکتومی اولیه تا تشخیص سرطان معده 23.1 سال بود. هشت بیمار بدون علایم بودند، از جمله چهار بیمار با تشخیص آدنوکارسینومای معده مرحله I. آدنوکارسینومای مرحله IV در 6 بیمار با متاستازهای کبدی (n=5) و صفاقی (n=1) شناسایی شد. دو بیمار با سرطان معده مرحله I قبلاً جراحی فورگات داشتند. یکی 15 سال پیش، روده برداری پانکراتیو برای آدنوکارسینومای آمپولار داشت و دیگری 10 سال قبل از تشخیص سرطان معده، روده برداری پروفیلاکتیک برای پولیپوز دوازدهه مرحله IV داشت. یک بیمار با آدنوکارسینومای متاستازی، 15 سال قبل از پولیپوز دوازدهه مرحله IV، پانکراس با روده برداری داشت. همه بیماران مرحله IV معده برداری درمانی انجام دادند. یکی در اثر عوارض پس از عمل 3 هفته بعد مرد و سه نفر به ترتیب 6، 8 و 9 ماه پس از جراحی زنده هستند. از 6 تشخیص متاستاز، 4 نفر در میانگین 4.5 ماه پس از تشخیص مردند. دو نفر کمورادیوتراپی تسکینی به مدت 2 و 19 ماه دریافت کردند.

بخشی از مقاله انگلیسی:

Introduction

The hereditary colorectal cancer syndrome familial adenomatous polyposis (FAP) is caused by a germline mutation in the adenomatous polyposis coli (APC) gene. The leading causes of cancer in FAP patients are colorectal, duodenal, and thyroid [1, 2]. Numerous guidelines have established surveillance recommendations for prevention of these FAP related cancers [3–5]. Gastric cancer is not cited as a health risk in Western FAP patients with a reported lifetime risk of 0.6%, similar to the general population risk [6]. Gastric polyps are commonly noted on surveillance upper endoscopy recommended for duodenal polyposis. The most commonly observed lesions are fundic gland polyps (FGP). Bianchi et al. demonstrated FGP in 88% of FAP patients with low grade foveolar dysplasia seen in 38% and high grade foveolar dysplasia in 3%. Factors associated with the finding of foveolar dysplasia include FGP size, duodenal polyposis stage, antral gastritis, and lack of acid-suppressive therapy [7]. We report the sudden rise in the incidence of gastric cancer in FAP patients enrolled in a hereditary colon cancer registry and the associated demographic, endoscopic and histologic features in these patients.

Methods

767 patients with the clinical diagnosis or genotype of familial adenomatous polyposis (FAP) or attenuated familial adenomatous polyposis (aFAP) who have had at least one esophagogastroduodenoscopy were accessed through the IRB approved Cologene™ database of the David G. Jagelman Inherited Colorectal Cancer Registries in the Sanford R. Weiss, M.D., Center for Hereditary Colorectal Neoplasia. Patients with gastric cancer were identified through the investigator and query of the Cologene™ database. From time of registration to time of diagnosis, all endoscopic surveillance procedures including EGD, endoscopic ultrasound, endoscopic mucosal resection, and endoscopic submucosal dissection were reviewed. Information extracted included polyp morphology, location, sizes, and histology. The follow-up period extended from either time of diagnosis to death or time of diagnosis to November, 2016. For statistics, continuous data were described as mean with and range as appropriate. Categorical data were described as raw numbers and percentages or proportions. The standardized incidence ratio (SIR) was calculated as the ratio of observed gastric cancer cases to the expected number of cases estimated using the SEER database of gastric cancer.

Results

Medical records of 767 FAP patients who underwent one or more upper endoscopies between January 2001 and November 2016 were reviewed. Since the inception of the registry in 1979, no case of gastric adenocarcinoma was seen until 2006. Nine more cases were diagnosed between 2012 and 2016 for a total of 10/767 (1.3%) cases resulting in a standardized incidence ratio of 140. All cases arose in patients with a carpeting of fundic gland polyposis and polypoid masses of gastric polyps in the proximal stomach including the fundus and body. The mean age at cancer diagnosis was 57 years (range 35–75) and six were female. The average interval from initial colectomy to gastric cancer diagnosis was 23.1 years. Eight patients were asymptomatic including four patients diagnosed with stage I gastric adenocarcinoma. Stage IV adenocarcinoma was detected in 6 patients with liver (n=5) and peritoneal (n=1) metastases. Two patients with stage I gastric cancer had previous foregut surgery. One had a pancreaticoduodenectomy for an ampullary adenocarcinoma 15 years prior and the other underwent a prophylactic pancreas preserving duodenectomy for stage IV duodenal polyposis 10 years before the gastric cancer diagnosis. One patient with metastatic adenocarcinoma had a pancreas preserving duodenectomy 15 years prior for stage IV duodenal polyposis. All patients with stage I disease underwent curative gastrectomy. One died of postoperative complications within 3 weeks of surgery and three are alive 6, 8 and 9 months after surgery, respectively. Of the 6 diagnosed with metastatic disease, 4 died within a mean 4.5 months after diagnosis. Two have been receiving palliative chemoradiation for 2 and 19 months, respectively

شناسایی مکانیزم تعامل lncRNA-miRNA-mRNA در سرطان پستان بر اساس تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکی

Identification of an lncRNA‑miRNA‑mRNA interaction mechanism in breast cancer based on bioinformatic analysis

Abstract

Non-coding RNAs serve important roles in regulating the expression of certain genes and are involved in the principal biological processes of breast cancer. The majority of studies have focused on defining the regulatory functions of long non-coding RNAs (lncRNAs) and microRNAs (miRNAs/miRs), and few studies have investigated how lncRNAs and miRNAs are transcriptionally regulated. In the present study, based on the breast invasive carcinoma dataset from The Cancer Genome Atlas at cBioPortal, and using a bioinformatics computational approach, an lncRNA-miRNA-mRNA network was constructed. The network consisted of 601 nodes and 706 edges, which represented the complex web of regulatory effects between lncRNAs, miRNAs and target genes. The results of the present study demonstrated that miR-510 was the most potent miRNA controller and regulator of numerous target genes. In addition, it was observed that the lncRNAs PVT1, CCAT1 and linc00861 exhibited possible interactions with clinical biomarkers, including receptor tyrosine-protein kinase erbB-2, estrogen receptor and progesterone receptor, demonstrated using RNA-protein interaction prediction software. The network of lncRNA-miRNA-mRNA interactions will facilitate further experimental studies and may be used to refine biomarker predictions for developing novel therapeutic approaches in breast cancer.

1 Introduction

Breast cancer was the most common malignancy in women worldwide in 2015 (1). Breast cancer is a clinically heterogeneous disease, encompassing multiple histological types, pathological characteristics and a variety of clinical behaviors, making clinical management difficult (2). Numerous studies have sought to understand the pathogenesis of breast cancer, and to determine biomarkers for use as diagnostic and prognostic tools. A primary focus of research has been to investigate the role of microRNAs (miRNAs/miRs) in breast cancer (3). The first observation of miRNA deregulation in breast cancer was by Iorio et al (4), who performed microarray analysis to evaluate the miRNA expression profiles of 76 neoplastic breast tissue and 10 healthy adjacent tissue samples, and identified 29 disordered miRNAs, including miR-10b, miR-125b, miR-145, miR-21 and miR-155, which emerged as the most consistently deregulated in breast cancer. In order to elucidate the association between miRNAs and cancer metastasis, Farazi et al (5) conducted Solexa sequencing of small RNAs from 11 healthy breast tissue samples, 17 ductal carcinoma in situ samples, 151 invasive breast carcinoma samples and 6 cell lines; 269 novel miRNAs were identified and it was demonstrated that patients with increased expression of miR-423 were more likely to develop metastasis.

In addition to miRNAs, long non-coding RNAs (lncRNAs) have emerged as important factors contributing to the development and progression of breast cancer (6). lncRNAs are a heterogeneous group of non-coding RNAs, including the newly-discovered long intervening non-coding RNAs (lincRNAs), and they are defined as larger than 200 bp in length (7). Gupta et al (8) demonstrated that lincRNAs in the HOX loci become systematically dysregulated in breast cancer, and identified the lincRNA HOTAIR to be overexpressed in primary breast tumors and metastases; therefore, HOTAIR may serve as a predictor of eventual metastasis and mortality in primary mammary tumors.

Numerous studies have been performed on breast cancer; however, further research is required to elucidate the mechanisms involved and identify novel methods of treating breast cancer. The association between lncRNAs and miRNAs in human diseases has been previously studied, including some evidence to suggest that non-coding RNAs may act as competing endogenous RNAs (ceRNAs) (9,10). Wang et al (11) provided experimental evidence that non-coding RNAs may form an lncRNA-miRNA-mRNA interaction network to regulate liver cancer; it was demonstrated that the lncRNA HULC may function as an endogenous sponge, which interacts with and downregulates miRNA-372 and thereby decreases the translational repression of its target gene.

lthough a number of regulatory mechanisms influencing the association between gene expression and protein expression have been elucidated, the involvement of numerous lncRNAs and miRNAs in transcriptional regulation has not been investigated in breast cancer. In the present study, a bioinformatics approach was used to predict the regulatory mechanisms of miRNAs and lncRNAs, and to construct the lncRNA-miRNA-mRNA network in breast cancer. The results of the present study represent a view of breast cancer from a concurrent analysis of lncRNA, miRNA and mRNA

بیان ژن مرتبط با سلول بنیادی سرطان به عنوان یک بیومارکر بالقوه برای پاسخ به ایمی پریدن ONC201 رده اولی در تومورهای جامد

Cancer stem cell-related gene expression as a potential biomarker of response for first-inclass imipridone ONC201 in solid tumors

Abstract

Cancer stem cells (CSCs) correlate with recurrence, metastasis and poor survival in clinical studies. Encouraging results from clinical trials of CSC inhibitors have further validated CSCs as therapeutic targets. ONC201 is a first-in-class small molecule imipridone in Phase I/II clinical trials for advanced cancer. We have previously shown that ONC201 targets selfrenewing, chemotherapy-resistant colorectal CSCs via Akt/ERK inhibition and DR5/TRAIL induction. In this study, we demonstrate that the anti-CSC effects of ONC201 involve early changes in stem cell-related gene expression prior to tumor cell death induction. A targeted network analysis of gene expression profiles in colorectal cancer cells revealed that ONC201 downregulates stem cell pathways such as Wnt signaling and modulates genes (ID1, ID2, ID3 and ALDH7A1) known to regulate self-renewal in colorectal, prostate cancer and glioblastoma. ONC201-mediated changes in CSC-related gene expression were validated at the RNA and protein level for each tumor type. Accordingly, we observed inhibition of self-renewal and CSC markers in prostate cancer cell lines and patient-derived glioblastoma cells upon ONC201 treatment. Interestingly, ONC201-mediated CSC depletion does not occur in colorectal cancer cells with acquired resistance to ONC201. Finally, we observed that basal expression of CSC-related genes (ID1, CD44, HES7 and TCF3) significantly correlate with ONC201 efficacy in >1000 cancer cell lines and combining the expression of multiple genes leads to a stronger overall prediction. These proof-of-concept studies provide a rationale for testing CSC expression at the RNA and protein level as a predictive and pharmacodynamic biomarker of ONC201 response in ongoing clinical studies.

1 Introduction

Several clinical studies have demonstrated the relevance of cancer stem cells (CSCs) that clearly correlate with recurrence, metastasis and poor survival in solid tumors [1–3]. Recent objective responses observed in Phase I/II clinical trials of various CSC-targeted agents in a number of advanced refractory solid tumors have further established the importance of CSCs as a therapeutic target [4–6].

The first-in-class small molecule imipridone ONC201 is currently in Phase I/II clinical trials for advanced cancer [7]. The first-in-human Phase I study in advanced solid tumors demonstrated ONC201 to be safe, and exhibit predicted pharmacokinetics, sustained pharmacodynamics and tumor shrinkage [8]. The anti-CSC efficacy of ONC201 has been previously demonstrated in vitro and in vivo in colorectal cancer and acute myeloid leukemia (AML) [9, 10]. ONC201-mediated depletion of chemotherapy-resistant colorectal CSCs involves dual inactivation of Akt and ERK signaling that results in transcription factor Foxo3 activation that leads to DR5/TRAIL-dependent inhibition of self-renewal [9, 11]. In the current study, we evaluated whether the anti-CSC effects of ONC201 involve early changes in stem-cell related gene expression prior to tumor cell death. We examined if ONC201-mediated inhibition of CSCs extends to other solid tumors. Additionally, we tested whether CSC expression can serve as a potential biomarker of ONC201 response.

مقالات انگلیسی و ترجمه های فارسی رایگان با فرمت PDF آماده دانلود رایگان میباشند

همچنین ترجمه مقاله با فرمت ورد نیز قابل خریداری و دانلود میباشد

مقاله انگلیسی رایگان (PDF)

ترجمه فارسی رایگان (PDF)

خرید ترجمه با فرمت ورد

فهرست مقاله:

مقدمه
تاریخچه ای کوتاه
بیوژنز و عملکرد miRNA
miRNA و تنظیم ترجمه
آغاز ترجمه
MiRNAs و سرطان
نتیجه گیری

بخشی از ترجمه فارسی مقاله:

 مقدمه
پیشرفت های اخیر در تحلیل ترانسکریپتوم و فناوری های مولد و پرتون نشان دهنده پیچیدگی بالای دنیای RNA است. شناخته شده ترین مناطق RNA، ژن های کد کننده پروتین، MicroRNAs، می باشند که 1.5 درصد ژنوم انسان را شامل می شوند. اهمیت MicroRNAs کد کننده کاملا شناخته شده است زیرا به مدت سالیان مختلف پایه و اساس زیست شناسی تجربی بوده است و به تشخیص سیستمی ژن های کد کننده در گونه های مختلف انجامیده است. در عین حال رتروترانسپوزون ها، عناصر ژنتیکی به تنظیم بیان ژن کمک می کنند. چون RNA به عنوان مسئله اصلی تنظیم ژنتیکی محسوب می شود، ایده حاوی اطلاعات اساسی به کلاس های جدیدی از RNA توسعه داده شده است. اخیرا، بخش کد کننده غیر پروتینی توجه زیادی را به دلیل نقش غیر منتظره خود در تظیم رشد و بیماری کسب کرده است. امروزهف بیشتر دانشمدان بر این باور هستند که رونویسی ژنوم انسان بسیار وسیع است و این مسئله موجب افزایش سوالاتی در خصوص کارکرد RNA ها می شود.
کشف RNA های غیر کد کننده موجب تغییر شیوه نگرش ما به ژنوم انسان شده و جهان علم را قادر به شناسایی انواع متفاوتی از ncRNAs در سلول های انسانی کرده است. اگرچه یک مرز مشخصی از کلاس های ncRNAs وجود ندارد، آنها بر طبق طول نوکولئوتید شان در سه گروه اصلی طبقه بندی می شوند: ncRNAs های کوتاه، ncRNAs های با اندازه متوسط و ncRNAs های با طول بلند. در میان ncRNAs های کوتاه، می توان بین microRNAs و RNAs (piRNAs) انتخاب کرد و به ترتیب دارای 19 تا 25 جفت باز و 26-31 جفت باز است. miRNAs در تنظیم بیان زن در سطح پایداری و ترجمه نقش دارد، در حالی که piRNAs در متیلاسیون DNA و مهار ترانسپوزون نقش دارد.RNA های هسته ای کوچک، بخشی از RNA های با اندازه متوسط بوده و به عنوان راهنمایی برای اصلاحات Rrna عمل می کند. lncRNAs در چندین فرایند پاتولوژیکی و بیولوژیکی نظیر نقش پذیری ژنومی، تنظیم تلومر، غیر فعال سازی کروموزوم ایکس ، رشد، چند توانی سلول های بنیادی، تنظیم ایمنی، پیشرفت سرطان و پتانسیل متاستاز ایفا می کنند. به طور ویژه، یک زیرمجموعه ای از ncRNAs، T-UCR، میکرو RNA ها را هدف یابی می کنند. ارتباط بین این lncRNAs و microRNAs مانع از تجزیه رونویسی می شود. لازم به ذکر است که تعریف ncRNAs بستگی به ابزار های بیو انفورماتیک دارد که در آینده ای نزدیک به چالش کشیده می شود. به طور ویژه، قالب های باز خواندن کوتاه تر از 100 نوکلوتید و یا فاقد توالی ATG قوی برای شروع ترجمه، به صورت غیر کد کننده در نظر گرفته می شود. از حیث ظهور مکان های شروع ترجمه جایگزین، می توان کشف کرد که حداقل برخی از ncRNAs ها برای پپتید های کوچک کد کننده هستند.
اهمیت ترانسکریپتوم غیر کد کننده در درک بیماری های انسانی با تعداد زیادی از ncRNAs ها که به طور ناهنجار در سرطان، بیماری قلبی و عصبی یا اختلالات ایمنی بیان می شوند برجسته تر می شود. در این رابطه، RNAs های کوچک توجه بسیاری از محققان را جذب کرده است. از این روی ما بر microRNAs و نقش آن ها در تنظیم ترجمه و سرطان تاکید می کنیم. در نهایت ما به بررسی بیان microRNAs در سرطان و پتانسیل آن ها در تولید دارو های جدید می پردازیم.
MicroRNAs: کشف و بیوژنز
تاریخچه ای کوتاه
MicroRNAs ها RNA های تک رشته ای و غیر کد کننده با 19 تا 25 نوکلوتید طول می باشند که هم در جانوران و هم در گیاهان یافت شده و در عین حال در تنظیم رونویسی نقش دارند. دو دهه پیش، وجود microRNAs مبهم بود و جامعه علمی بر ژن های کد کننده پروتین تاکید داشتند.
با این حال در 1993، به مدت هفت سال پس از کشف lin-4 RNA، ژنومیک این نوع RNA تنظیم کننده ساده تر شده است به طوری که هیچ شاهدی برای RNA های شبه lin-4 فراتر از نماتد ها وجود نداشته و علایم RNA های غیر کد کننده مشابه درون نماتد ها وجود نداشته است. این مورد همگی منجر به کشف LET7 شده است که یک ژن دیگر در مسیر هتروکرونیک الگانس بوده و دومین RNA تنظیم کننده 22 نوکلوتیدی را کد گذاری کرده است. let 7 RNA موحب افزایش انتقال و کذار از مرحله اواخر لاروی به سلول های بالغ همانند LIN-4می شود. به علاوه، همولوگ های ژن Let7 در انسان و ژنوم مگس، و let 7 RNA در انسان ، مگس سرکه شناسایی شده است( راسکالینی و همکاران 2000).جهش در این ژن با بر هم زدن نظم در مراحل رشد و نمو، موجب عدم تغییر سلول های جنینی از اولین مرحله لاروی L1 به مراحل بعدی می شود. محققان بر این باورند که از ژن Lin-4 پروتینی سنتز نمی شود و به جای آن دو نوع RNA کوچک ساخته می شود:یک RNA کوتاه 22 نوکلوتیدی Lin-4-s و RNA دیگری که طول بیشتری در حدود 60 نوکلوتید دارد. مطالعات بعدی توسط وایتمن نشان داده است که ژن Lin-4 تنظیم کننده منفی ژن Lin-14 می باشد. ژن اخیر پروتینی با عمر کوتاه تولید می کند و در نمو جنین کرم نقش دارد. نکته جالب، تلاقی زمانی کارکرد تنظیمی و غیر مداوم Lin-4 RNA و با بیان پروتین LIN-14 می باشد. در واقع با حضور Lin-4 RNA، میزان پروتین LIN-14 تا بیست برابر کاهش می یابد. تحقیقات امبروس و راکون نشان داده است که در بخش 3 UTR، در m-RNA ژن Lin-4، قسمت های مختلفی وجود دارند که از نظر توالی مکمل توالی Lin-4 RNA می باشند. هم چنین ادامه تحقیقات نشان داد که اتصال بین این دو مولکول RNA، دلیل اصلی اثر منفی Lin-4 RNA و Lin-14 m-RNA است. به علاوه اتصال ذکر شده تنها موجب کاهش میزان پروتین LIN-14 می شود و بر مقدار Lin-14 MRNA هیچ تاثیری ندارد. به مدت هفت سال، از 1993 تا 2000، Lin-4 تنها مولکول RNA شناخته شده ای بود که با اتصال به مولکول RNA دیگر، بیان پروتین آن را مهار می کرد. ولی در 2003، پژوهش رینهارت و همکاران منجر به کشف RNA جدید موسوم به LET-7 در نماتود الگانس شد که نقش مشابه با LIN-4 داشت.

بخشی از مقاله انگلیسی:

INTRODUCTION

Recent advances in transcriptome analysis and high throughput technologies highlighted an impressive complexity in the RNA world. The most studied RNA regions are protein-coding genes, mRNAs, accounting for around 1.5% of the human genome[1]. The importance of coding mRNAs is undisputable as they have been for years the building brick of experimental biology, culminating in the systematic deletion of coding genes in several species. Not less important are retrotransposons, specific genetic elements which are known to regulate gene expression[2,3]. Since RNA was identified as the crux of genetic regulation, the idea that it carries fundamental information has been extended to novel classes of RNA. More recently, the nonprotein coding portion of the genome gained attention due to its unexpected role in regulating development and disease[4]. Nowadays, most scientists agree in stating that transcription of the human genome is pervasive, therefore raising questions on the function of many uncharacterized RNAs. The discovery of non-coding RNAs (ncRNAs) has changed the way we look at the human genome and led the scientific world to characterize the different types of ncRNAs transcribed in human cells. Although there is not a clear delineation of ncRNA classes, they are usually classified, according to their nucleotides length, in three main groups: Short ncRNAs, mid-size ncRNAs and long ncRNAs[5]. Among short ncRNAs we can distinguish between microRNAs (miRNA) and piwiinteracting RNAs (piRNAs), respectively 19-25 base pairs (bp) and 26-31 bp long. miRNAs are involved in the regulation of gene expression at the translational and stability level[6-8], while piRNAs are involved in DNA methylation and transposon repression[9-11]. Small nucleolar RNAs (60-300 bp) are part of mid-size RNAs and act as guides for rRNA modifications[12], Promoter Associated RNAs (22-200 bp) belong to the same group but their function is obscure[13]. Last but not least, long non-coding RNAs (lncRNAs) comprise all ncRNAs longer than 200 nucleotides and include the largest portion of the non-coding transcriptome[4]. lncRNAs are involved in several biological and pathological processes, such as genomic imprinting, telomere regulation, X-chromosome inactivation, development, stem cell pluripotency, immune regulation, cancer progression and in metastatic potential[14,15]. In particular, a subset of lncRNAs, the T-UCR, themselves target specific miRNAs. The binding between these lncRNAs and miRNAs prevents target transcription degradation determining an intricate coregulation between lncRNAs and miRNAs[16-18] and strictly linking these two different types of ncRNAs. It should be however stressed out that the definition of ncRNA relies mainly on bioinformatic tools that are likely to be challenged in the next future. In particular, open reading frames (ORF) shorter than 100 nucleotides and/or lacking a strong ATG consensus sequence for translational start are considered noncoding. In view of the emergence of alternative translational start sites[19], we may discover that at least some ncRNAs are indeed “coding” for small peptides. The relevance of the non-coding transcriptome in the comprehension of human diseases is highlighted by the impressive number of ncRNAs that are abnormally expressed in cancer, in neurological and heart diseases or in immune disorders. In this context, short RNAs have attracted the attention of most researchers. Here, we focus on miRNA and on their role in translation regulation and cancer. In particular we zoom in the known mechanisms of miRNA-regulated translation, after a brief elucidation of their discovery and biogenesis. Finally, we account for the aberrant expression of miRNAs in cancer and for their therapeutical potential as new drugs.

miRNA: DISCOVERY AND BIOGENESIS

A brief history miRNAs are endogenous, non-coding single stranded RNAs of approximately 19-25 nucleotides in length, found both in animals and plants and involved in post transcriptional regulation[7,20]. Two decades ago the existence of miRNAs was obscure and the scientific community was focused largely on protein-coding genes. However in 1993 the discovery of the first small ncRNA lin-4, in C. elegans, has totally changed the scientists’ point of view[21]. At the time of the first discoveries, two main questions were raised: (1) what is the role of lin-4; and (2) what is its mechanism of action? Genetic studies showed that lin-4 is one of the most relevant genes involved in the control of temporal development of larval stages[22,23]. Almost simultaneously, Lee and collaborators discovered that null mutations of the lin-14 gene were able to cause an opposite phenotype to null lin-4 mutations, suggesting that lin-4 could regulate lin-14[23,24]. How was this regulation taking place? Several groups unequivocally demonstrated that the introduction of mutations in the putative ORF of the lin-4 gene, did not affect its function, concluding that lin-4 did not encode for a protein. Mature lin-4 was found to be present in two small transcripts with different lengths, 22 and 61 nucleotides[24]. Furthermore, mutations in the 3’UTR of lin-14 mRNA and gene fusion experiments showed that lin-14 was downregulated posttranscriptionally by lin-4, delineating the 3’UTR of lin-14 as necessary for the regulation of LIN-4 protein levels[25,26]. These data led to a unified conclusion: lin-4 transcripts were complementary to the 3’UTR of the lin-14 gene and regulated its expression by annealing to its 3’UTR. With a similar approach, seven years later another miRNA was discovered, let-7, which was able to regulate lin-41 expression by binding to its 3’UTR[27,28]. Further, the sequence of let-7 was found conserved among species, from flies to humans. A new era in transcriptomics was now open for study by the entire scientific world!

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

تست های کشت سلولی
برای ارزیابی جذب سلولی کورکومین، سلول های سرطانی HeLa از موسسه پاسچر تهران، ایران خریداری شد. سلولها در محیط موسوم به Roswell Park Memorial ( شهری در نیو مکزیکو) با 10٪ سرم جنین گاوی و 1٪ پنی سیلین / استرپتومایسین در 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور CO2 کشت داده شدند. سلول ها با غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر آزاد کورکومین یا بارگیری و ترکیب شدند. پس از 24 ساعت، سلولهای مورد آزمایش با PBS شسته شدند و سپس تحت میکروسکوپ فلورسانس معکوس بررسی شدند. (ابزار نیکون، ملویل، نیویورک، ایالات متحده آمریکا). به منظور ارزيابي اثرات سيتوتوكسيك نيتروژن كركومين، فيبروبلاست هاي فوربك پوست انسان و سلول هاي HeLa با تراكم 103 × 7 ميكروليتر در صفحات 96 كيلويي بذر كشت داده شدند و با غلظت هاي متفاوت كركومين آزاد و كپسول شده به مدت 48 ساعت انكوبه شدند. سپس (MTT 5 میلی گرم بر میلی لیتر) به هر چاه اضافه شد و سلول ها در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 4 ساعت انکوباتور شدند. برای حل شدن رسوب فرانسان آبی، دی متیل سولفوکسید اضافه شد و جذب در 570 نانومتر توسط یک ارزیابی کننده ELISA (BioTek، Winooski، VT، USA) تعیین شد. 

رنگ آمیزی هسته ای
همانند آزمایش MTT، سلول از خط سلولی HeLa کشت شدند و به مدت 48 ساعت با NP خالص، کورکومین یا NPC های کورکومین انکوباتور شدند. سپس، سلول ها با PBS شسته شدند و با پروما فرمالدئید 4٪ ثابت به مدت 20 دقیقه ثابت می شدند. پس از شستشو با PBS، برای افزایش نفوذ پذیری، 0.2٪ Triton X-100 به مدت 20 دقیقه اضافه شد؛ در مرحله نهایی، رنگ آمیزی هسته ای به مدت 25 دقیقه با استفاده از DAPI (1 میکروگرم در میلی لیتر سانتا کروز بیوتکنولوژی، سانتا کروز، CA، USA) انجام شد و سلول ها تحت یک میکروسکوپ فلورسنت (نیکون) مشاهده شدند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی کمی (qRT-PCR)
سلول های HeLa به مدت 48 ساعت با NP های خالی، کورکومین و CF-ALG-STPP NPC (50 میکروگرم بر میلی لیتر) کورکومین انکوباتور شدند. سپس آنها با PBS شسته شدند و RNA با استفاده از کل کیت استخراج RNAیکتا تاجیز، تهران، ایران) بر اساس پروتکل تولید کننده استخراج شد. سنتز cDNA با استفاده از کیت رونویسی شده معکوس تجاری (یکتا تاجیز) انجام شد. در مجموع 20 میکرولیتر مخلوط واکنش حاوی 4/0 میکروگرم پرایمر جلو، 0.4 میکروگرم مبدل برگشتی، 2 میلی لیتر cDNA، 10 میکرو لیتر SYBR سبز PCR ترکیبی اصلی(یکتا تاجیز)، 0.4 میکرولیتر کربوکسی-ادرادامین (یکتا تاجیز) و 6.8 میلی لیتر RNase آب آزاد GAPDH به عنوان یک کنترل داخلی مورد استفاده قرار گرفت. سطح ویژگی ژن با روش Ct تجزیه و تحلیل شد. جدول S1 توالی پرایمر و دمای آنیلینگ را نشان می دهد.

تحلیل آماری
داده های آزمون MTT با استفاده از آزمون آماری t مستقل تجزیه و تحلیل شد. نتایج qRT-PCR با استفاده از تجزیه واریانس یک طرفه و سپس پس آزمون توکی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتايج به صورت ميانگين ± خطاي استاندارد ميانگين و p-value 0.05 به صورت آماري معني دار در نظر گرفته شدند.

نتایج
خواص نانوذرات CS -ALG -STPP NPC حاوی کورکومین
نتایج FE-SEM نشان داد که NP-CFC-ALG-STPP دارای کورکومین کروی و اندازه متوسط ~ 50 نانومتر است که با یکدیگر جمع و متراکم می شوند (شکل 1A. ). شکل 1B یک تصویر AFM و نمای سه بعدی آن را نمایش می دهد. مطابق با داده های FE-SEM، اندازه گیری نتایج AFM نیز نشان می دهد که ذرات دارای توزیع اندازه یکنواخت هستند و اندازه های متوسط نانوذرات کورکومین بارگذاری شده 50 نانومتر است (شکل 1C.)

تجزیه و تحلیل طیف سنجی FT-IR
شکل 2 طیف های FT-IR از کورکومین، CS-ALG-STPP و NC-ALG-STPP ترکیب شده کورکومین را نشان می دهد. در طیف نانوذرات CS-ALG-STPP، گروه وسیعی در 3،432 cm-1 به گروه هیدروکسیل و آمین مربوط می شود.

رئوس یا پیکهای نزدیک به 1630 و 1413 سانتیمتر مربع به ارتعاشات متقارن و نامتقارن کششی گروه های COO اختصاص یافته است. علاوه بر این، باند حدود 1،026 cm-1 متعلق به باندهای آمید است. اوج 1،087 cm-1 به علت وجود -CH-OH در الکل سیلیکونی و کشش C-O است. برای کورکومین، پیک در 3،478 سانتیمتر 1 مربوط به گروه های آمین است. پیک جذب در 1510 سانتیمتر مشاهده می شود که مربوط به ارتعاشات C = O و C = C کورکومین است.
علاوه بر این، پیک جذب برای باندهای دوگانه C = C در 1 627 cm-1 در این طیف به دلیل همپوشانی با اوج CS-ALG-STPP واضح نیست. شدت اوج نسبی نانوذراتCFC-ALG-STPP کورکومین کمی ضعیف است، که ممکن است به دلیل وابستگی کورکومین به گروههای کاربردی ماتریس CS-ALG باشد.

راندمان جذب
برای ارزیابی کارایی انکپسولاسيون، تجزیه HPLC بر روی محلول ریخته شده، محلول پس از شستشو با اتانول و مخلوط نانوذراتCS-ALG-STPP کرکومین در آب انجام شد. با محاسبه منطقه زیر پیک، بازده نهایی برای آماده سازی NP حدود 70٪ بود (شکل 3).

انتشار کورکومین در محیط آزمایشگاهی از CS -ALG -STPP NP
مشخصات آزمایشی دارو در یک زمان معین مورد بررسی قرار گرفت و درصد کورکومین آزاد شده از NP-CS-ALG-STPP با استفاده از منحنی استاندارد اندازه گیری شد. شکل 4 آزمایشی آزمایشی داروی NPc کرکومین را نشان می دهد. داده های ما نشان داد که 24٪ و 29٪ از کورکومین پس از 1 و 2 ساعت از NP ها ، به ترتیب آزاد می شوند. سپس، رهاسازی کنترل شده شديد تا 24 ساعت مشاهده شد و 53٪ از کورکومين بارور شده فيزيکي در اين دوره آزاد شد (شکل 4).

جذب کورکومین و نانوذرات CS -ALG -STPP
فرایند ایزوترم برای ارزیابی ظرفیت بارگیری کورکومین بر روی NP-CS-ALG-STPP انجام شد. شکل 5، ایزوترم جذب برای کورکومین و NP-CS-ALG-STPP را نشان می دهد. نتایج تجربی مناسب با معادلات ایزوترم لانگمویار، فروندلیچ، تمکین، الوویچ و لانگمویر فروندلیچ بودند. جدول 1 داده های ایزوترم جذب برای کورکومین را در NP-CS-ALG-STPP و پارامترهای تعادلی نشان می دهد. تجزیه و تحلیل رگرسیون نشان داد که در بین ایزوترم های ذکر شده، مدل ایزوترم لانگموری-فروندلیچ بیشترین خطی بودن را نشان می دهد (R2 = 992).

آزمایشات درون آزمایشگاهی
بر اساس فعالیت فلورسانس ذاتی کورکومین، جذب آن در سلول های HeLa، 48 ساعت پس از انکوباسیون NPC-ALG-STPP NPC کورکومین مورد بررسی قرار گرفت. تصاویر میکروسکوپی فلورسنس نشان داد که سلول های کنترل و آنهایی که با NP-CS-ALG-STPP انکوباتور به عنوان گروه آزمایشی خالی نانوذرات هیچ فعالیت فلورسانس نشان نمی دهد. در مقایسه با گروه های آزمایشی کنترل و خالی ناقل NP ، سلول های HeLa که با آزاد کورکومین یا NPC کروکومین (50 میکروگرم بر میلی لیتر) تحت درمان با فلورسانس سبز قرار گرفته اند (شکل 6A). در مرحله بعد، اثر سیتوتوکسی NPs کرکومین بارگذاری شده با استفاده از آزمون MTT ارزیابی شد. فیبروبلاست های پیش پوست انسان و سلول های HeLa به مدت 48 ساعت با دوزهای مختلف کربوکامین آزاد یا کورکومین بارگذاری نشده CS-ALG-STPP NP (6.25، 12.5، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلی لیتر) انکوباتور شدند. برای ارزیابی سمیت نارسایی های کورکومین بر روی سلول های طبیعی، فیبروبلاست های فورنچه پوست انسان کشت شدند و با غلظت های مختلف کورکومین نانوذرات ترکیبی با کورکومین به مدت 48 ساعت انکوباتور شدند. نتایج حاصل از MTT نشان داد که اثر سیتوتوکسیک قابل توجه در درمان سلول های کروموزوم طبیعی تحت درمان با نانوذرات کورکومین یا نانوذرات ترکیبی با کورکومین (شکل 6B) مشخص نشد. علاوه بر این، اثر سیتوتوکسی NP در بیماران مبتلا به سرطان HeLa مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آزمون زنده ماندن سلول نشان می دهد که NPs کرکومین بارگذاری شده، به ویژه دوز بالای آن ، اثر بازدارنده وابسته به دوز ، به تکثیر سلولی نسبت به گروه کوروکوم آزاد داشت (شکل 6B).

تغییر بافت شناسی موتانت EGFR آدنوکارسینوم ریه بدون قرار گرفتن در معرض مهار EGFR

Histologic transformation of EGFR mutant lung adenocarcinoma without exposure to EGFR inhibition

Abstract

Resistance to EGFR kinase inhibitors appears to be invariable in the treatment of non-small cell lung cancer. Several mechanisms have been described. Here, we report the first case of histologic transformation of EGFR mutant lung adenocarcinoma without prior exposure to EGFR inhibition

1- Introduction

Despite initial marked response to EGFR kinase inhibitors in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) harboring activating EGFR mutations, drug resistance develops within a median of 12 months. Described resistance mechanisms include secondary mutations within EGFR (e.g. T790M), MET amplification, PI3K pathway hyperactivation, HER2 amplification, AXL overexpression, and epithelial-to-mesenchymal transition. Additionally, in rare cases, EGFR mutant lung adenocarcinoma may undergo histologic transformation to small cell lung cancer and squamous cell cancer after EGFR inhibitor treatment [1,2]. Here, we report the first case of histologic transformation of EGFR mutant lung adenocarcinoma without prior exposure to EGFR inhibition.

2- Case report

During radiographic evaluation of a stage 3A invasive ductal carcinoma of the right breast, a 79-year old woman with no smoking history was found to have a right middle lobe mass (Fig. 1A). Biopsy demonstrated a TTF-1- and Napsin A-positive primary lung adenocarcinoma (Fig. 2A–C) harboring a classic EGFR exon 19 deletion (Fig. 3). She underwent right middle lobe lobectomy and mediastinoscopy, with a final diagnosis of stage 2 (T2N1M0) disease. The patient received three cycles of adjuvant carboplatin-pemetrexed chemotherapy (Fig. 1C). Subsequently she underwent partial right mastectomy, breast and axillary radiation therapy, and started tamoxifen. Approximately 13 months after completing adjuvant chemotherapy, surveillance chest CT demonstrated an enlarging nodule at the right cardiophrenic angle (Fig. 1D). Biopsy revealed squamous cell carcinoma (Fig. 2E–F) with no evidence of adenocarcinoma histology. Molecular analysis demonstrated the original EGFR exon 19 deletion and no evidence of T790M mutation (Fig. 3). Immunohistochemical analysis of both the original and subsequent lung tumors demonstrated Rb expression (images not shown), suggesting absence of small cell histology. For both the original and subsequent lung tumors, all available tissue underwent histologic review. The patient initiated erlotinib, with partial response lasting six months (Fig. 1E)

ارزیابی ایمنی RF دستگاه اتساع دهنده بافت پستان برای MRI: شبیه سازی عددی و آزمایش

RF Safety Evaluation of a Breast Tissue Expander Device for MRI: Numerical Simulation and Experiment

چکیده
چکیده
این مطالعه روش ارزیابی ایمنی فرکانس رادیویی مربوط به MRI (RF) دستگاههای اتساع دهنده بافت پستان را شرح داده و معیارهای ایمنی را تعیین می نماید. شبیه سازیهای عددی و اندازه گیریهای آزمایشی درفرکانس 64MHz با ژل فامتوم محتوی اتساع دهنده پستان انجام شدند. به علاوه، مدلسازی محاسباتی ( در فرکانس های 64 و 128MHz) با یک مدل خانم بالغ ، با دستگاه اتساع دهنده بافت پستان ایمپلنت شده مجازی برای چهار موقعیت لندمارک تصویربرداری، اجرا گردید. دستگاه اتساع دهنده بافت پستان منجر به تغییرات قابل توجهی در نرخ جذب خاص (SAR) و توزیع |B1 + | گردید. منبع اصلی تغییرات SAR با استفاده از دستگاه اتساع دهنده بافت پستان، کیسه پرشده با سالین اتساع دهنده بود. برعکس، تغییر میدان مغناطیسی RF (B1 + ) عمدتاً ناشی از پورت فلزی بود. مقادیر اندازه گیری شده دامنه میدان مغناطیسی، به خاطر وجود دستگاه اتساع دهنده، به طور قابل توجهی افزایش نیافتند. ماکزیمم مقادیر SAR متوسط 1 یا 10 گرم در بافتهای نزدیک ایمپلت پائین تراز حد انتظار در مناطق دیگر بدن بیماربود، در خط مرکزی کویل نرمال سازی |B1 + | برابر با 2 µT و SAR متوسط کل بدن برابر با 4W/kg بود.
1. مقدمه
سرطان آمریکا برآورد نمود که هر ساله در آمریکا بیش از 250000 مورد جدید از سرطان سینه رخ می دهد. بازسازی پستان پس از ماسکتومی معمولاً با استفاده از اتساع دهنده های بافت انجام شده و تکنیکی معمول برای بازسازی پستان به شمار می رود. طبق مطالعه انجام شده در سال 2003 مشتمل بر 1984 فرد مبتلا به سرطان سینه، تقریباً 49 درصد از افراد تحت ماسکتومی قرار گرفتند. این امر منجر به استفاده از تعداد قابل توجهی اتساع دهنده بافت پستان گردیده است. هرچند تعداد دقیق چنین دستگاههای مورد استفاده مشخص نیست، اما پایگاه داده سازمان غذا و دارو (FDA) نشان می دهد که بیش از 50 دستگاه اتساع دهنده بافت پستان از طریق فرایند FDA 510(k) ترخیص شده است.
بیمارانی که در آنها از اتساع دهنده بافت پستان استفاده می شود، بعضاً برای پیگیری باید MRI شوند. اما، نگرانیهای ایمنی حل نشده ای در رابطه با کاربرداین دستگاهها در محیط MR وجود دارد. به خاطر عدم وجود لیبل گذاری (برچسب) شرطی MR برای دستگاههای قبلاً ترخیص شده، اسکن MRI بیمارانی با این دستگاهها، یک شیوه بدون لیبل تلقی شده به همین خاطر نگرانیهای ایمنی باید به شکلی بهتر درک و توزیع شوند.
اتساع دهنده های بافت پستان از یک کیسه ( به عبارتی دیوار الاستومری)، با شل یا پوسته بیرونی سیلیکونی و یک شیر داخلی یا پورت فلزی خارجی برای تزریق مایع نمکی تشکیل می شوند. معمولاً، یک آهنربای دائمی کوچک در داخل پورت فلزی قرار داده می شود تا بدین طریق مکان اسلات تزریق برای تزریق سالین اضافی مشخص گردد. پس از کاشت (ایمپلنت) کیسه، به تدریج طی چند هفته با تزریق دوره ای سالین از طریق پورت، بزرگ می شود. زمانی که به اندازه هدف می رسد، دستگاه در نهایت با ایمپلنت دائمی پستان جایگزین می شود.
حضور پورت فلزی و آهنربا (مگنت) موجود در دستگاه، نگرانیهای ایمنی ممکن در محیط MRI، در رابطه با گرم شدن ناشی از فرکانس رادیویی (RF) بافت، گرم شدن ناشی از گرادیان و اثرات نیروهای مکانیکی و گشتاور بر دستگاه را افزایش می دهد. حضور فلز می تواند آرتیفکت های تصویر قابل توجهی نیز تولید نموده و منجر به از دست رفتن کاربرد تشخیصی تصاویر گردد. بنابراین، برای اتساع دهنده های بافت پستان بکاررفته در بیماران ماسکتومی، توسعه و ارزیابی دقیق اثرات محیط MRI ضروری می باشد.

Abstract

This study describes the MRI-related radio frequency (RF) safety evaluation of breast tissue expander devices to establish safety criteria. Numerical simulations and experimental measurements were performed at 64 MHz with a gel phantom containing a breast expander. Additionally, computational modeling was performed (64 and 128 MHz) with an adult female model, containing a virtually implanted breast tissue expander device for four imaging landmark positions. The presence of the breast tissue expander device led to significant alterations in specific absorption rate (SAR) and |B1 + | distributions. The main source of SAR alterations with the use of the breast expander device was the saline-filled pouch of the expander. Conversely, the variation of RF magnetic field (B1 + ) was mainly caused by the metallic port. The measured values of electric field magnitude did not increase significantly due to the introduction of the expander device. The maximum 1g- or 10gaveraged SAR values in tissues near the implant were lower than those expected in other regions of the patient body with normalization of both |B1 + | equal to 2 µT at the coil isocenter and whole body averaged SAR equal to 4 W/kg.

1. Introduction

THE American Cancer Society estimated that there are more than 250 000 new cases of breast cancer every year in the US [1]. Postmastectomy breast reconstruction is usually accomplished using tissue expanders and is a common technique used for breast reconstruction. According to a study published in 2003 involving 1984 breast cancer subjects, approximately 49% of the subjects underwent mastectomies [2]. This has resulted in a significant number of breast tissue expanders being used. Although the precise number of such devices in use is not available, the Food and Drug Administration (FDA) database indicates that more than 50 breast tissue expander devices have been cleared through the FDA 510(k) process [3].Patients with breast tissue expanders sometimes need to be imaged by MRI for follow-up. However, there are unresolved safety concerns pertaining to the use of these devices in the MR environment. Due to the absence of MR conditional labeling for these devices that have been previously cleared, the MRI scanning of patients with these devices is potentially an off-label practice and the safety concerns need to be better understood and disseminated. Breast tissue expanders are composed of a bladder (i.e., elastomer wall), with silicone outer shells and either an internal valve or external metallic port to allow for saline fluid injections. Typically, a small permanent magnet is embedded inside the metallic port to locate the injection slot for additional saline injections. After the pouch is implanted, it is then gradually expanded over a few weeks with periodic saline injections through the port. When the target size is reached, the device is eventually replaced with a permanent breast implant. The presence of the metallic port and the magnet contained in the device raises possible safety concerns in the MRI environment related to radio frequency (RF) induced heating of tissue, gradient-induced heating, and effects of mechanical forces and torque on the device [4]. The presence of metal can also generate significant image artifacts, which can in turn lead to the loss of diagnostic utility of the images. Thus, a careful development and evaluation of the effects of the MRI environment is needed for breast tissue expanders used in mastectomy patients.

ارزیابی ایمنی RF دستگاه اتساع دهنده بافت پستان برای MRI: شبیه سازی عددی و آزمایش

RF Safety Evaluation of a Breast Tissue Expander Device for MRI: Numerical Simulation and Experiment

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

حساسیت تست‌ چندگانه‌ی مخصوص برای الل
برای تعیین پایین‌ترین دقت محدوده‌ی تشخیص در تست‌ چندگانه‌ی مخصوص برای الل، DNA جهش‌یافته‌ی KRAS با DNA طبیعی مخلوط شد. میزان DNA جهش‌یافته به مرور کم‌تر و کم‌تر شد تا به کسرهای ۵٪، ۲.۵٪، ۱.۲۵٪، ۰.۶۲٪، ۰.۳۲٪ و ۰.۱۵٪ برسد. واکنش‌ها در قالب سه‌تایی و به همراه یک کنترل منفی انجام شدند.

نتایج
ژنوتایپینگ چندگانه‌ی مخصوص برای الل برای ژن KRAS
ما یک تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل طراحی کردیم که هدف آن غربالگری هفت جهش شایع برای KRAS در کدون‌های ۱۲ و ۱۳ در سرطان کارسینومای روده‌ی بزرگ است و در این راستا از تست PCR کمّی مخصوص برای الل استفاده کردیم (شکل ۱). مرحله‌ی اول شامل یک امپلیکون مرجع بدون جهش بود (واکنش کنترل) که همزمان با تست‌های چندگانه‌ی مخصوص برای الل انجام شد. پس از آن، یک تست تأییدی انجام دادیم که نتایجی تکرارپذیر و بدون اختلاط پرایمرهای مخصوص برای الل‌ها به دست می‌داد. شکل ۲ واکنش‌های تکثیری برای تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل و DNA هر یک از هفت جهش شایع در KRAS را نشان می‌دهد. مقادیر ΔCq در جدول ۱ نشان‌ داده‌ شده‌اند. همچنین، پرایمرهای مخصوص برای الل تنها الگوهای دارای توالی خاص را تکثیر کردند، چرا که PCR کمّی با استفاده از پرایمر مخصوص برای G12S، DNA مربوط به G12V را تکثیر نکرد (شکل ۳).

بررسی جهش ژنتیکی در KRAS با استفاده از نمونه‌های کارسینومای روده‌ی بزرگ
تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل که بر روی ۳۲ نمونه‌ی FFPE سرطان روده‌ی بزرگ انجام شد، در ۲۱ نمونه جهش شناسایی کرد. نمودارهای تکثیر در شکل ۴ نشان داده شده‌اند. واکنش‌ها در قالب سه‌گانه انجام شدند و انحراف‌های معیار منفی و مثبت برای مقادیر ΔCt در جدول ۲ نشان داده‌ شده‌اند. مقایسه‌ی تست‌های چندگانه‌ی مخصوص برای الل و توالی‌یابی سنگر در جدول ۲ ارائه شده است. در این مطالعه به وسیله‌ی PCR کمّی، ما به این نتیجه رسیدیم که ۲۲ از ۳۰ مورد که برای ژن KRAS بررسی شدند، محصولات قابل تکثیر PCR به دست دادند. ۶ مورد با استفاده از روش سنگر هیچ محصول قابل تکثیری به دست نداد، اما با استفاده از تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل،در KRAS جهش نشان داد. این ناهماهنگی بین تست چندگانه و روش سنگر، احتمالاً به دلیل بالا بودن کسر سلول‌های غیرتوموری و حساسیت بالاتر تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل است. در ۸ نمونه، هیچ محصول قابل تکثیری در پی روش سنگر و یا تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل به دست نیامد. ۷ نمونه از این نمونه‌ها، از درمان‌گاه‌های عمومی محلی گرفته شده و احتمالاً به دلیل پردازش نامناسب، متحمل تخریب و واسرشتی DNA شده بودند [۱۷]. این باور به این دلیل است که هیچ تکثیری در مورد این نمونه‌ها دیده نشد. در هر ۸ نمونه، نمونه‌های منفی سه بار با هر دو روش توالی‌یابی سنگر و تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل آزمایش شدند. نمونه‌های دیگر به دلیل عدم توانایی تکثیر امپلیکون جهش‌نیافته، تخریب‌شده انگاشته شدند.

حساسیت تست چندگانه‌ی PCR کمّی برای KRAS
برای اندازه‌گیری حساسیت و اختصاصی بودن تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل، DNAهای استاندارد مرجع که دارای ‌KRAS جهش‌یافته بودند رقیق شدند و با DNA مرجع مخلوط شدند. غلظت DNA جهش‌یافته به مرور کم‌تر و کم‌تر شد تا نسبت DNA جهش یافته به DNA سالم کم‌تر شود. ما می‌توانیم در تست چندگانه‌ تا ۰.۱۵٪(برابر با ۳۵ پیکوگرم) از ‌DNA جهش‌یافته را تشخیص دهیم. مثال‌های نماینده‌ی تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل با استفاده از جهش G12S در DNA ژن KRAS در شکل ۱ بخش تکمیلی مقاله نشان داده شده‌اند. برای سنجش حساسیت تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل، جهش‌های KRAS در مخلوط DNA شامل DNA جهش‌یافته و طبیعی با کسرهای گوناگون (۵٪، ۲.۵٪، ۱.۲۵٪، ۰.۶۲٪، ۰.۳۲٪ و ۰.۱۵٪) مقدارسنجی شدند. نتایج به گونه‌ای تکرارپذیر، خبر از وجود مقادیر مقایسه‌پذیر الل‌های جهش‌یافته‌ی KRAS در همه‌ی دفعات آزمایش دادند. میانگین انحراف معیار مثبت و منفی برای ΔCq که در جدول ۳ نشان داده شده‌اند به وضوح ردیابی جهش‌های شایع KRAS را ممکن ساختند. با این حال، در غلظت‌های پایین‌تری DNA جهش‌یافته، تست چندگانه‌ی ما بیشتر G12S، G13D و G12C را ردیابی کرد.

بحث
با توجه به این که جهش‌های KRAS با مقاومت به روش‌های علیه EGFR (به وسیله‌ی کتاکسیمب و پانیتومامب) هم‌راستایی نشان می‌دهد، نیاز به تست‌های سریع، ارزان‌قیمت و پُرداده حس می‌شود که جهش‌های KRAS را در نمونه‌های بالینی تشخیص دهند. روش‌های توالی‌یابی نسل بعد (NGS) به شدت توصیه می‌شوند، اما استفاده از آن‌ها فراتر از توانایی مالی و تخصصی آزمایشگاه‌های بالینی معمولی است. با این که توالی‌یابی به روش سنگر استاندارد طلایی برای شناسایی جهش‌های DNA محسوب می‌شود، حساسیت پایین آن نیاز به درصدهای بالاتری از سلول‌های توموری (برای مثال، ۱۰ تا ۳۰٪) به دلیل اتصالات ضربدری DNA و یا تخریب DNA به وسیله‌ی فرمالین و یا میزان کم توالی هدف، ایجاد می‌کند [۲۷، ۲۸].
در جدول ۲، برخی نمونه‌های FFPE هم در تست چندگانه‌ی ما و هم در روش توالی‌یابی سنگر نتیجه‌ای به دست ندادند. بافت‌هایی که قادر به تکثیر DNA جهش‌نیافته‌ی کنترل نبودند، از درمان‌گاه‌های محلی گرفته شدند که امکانات و تخصصی محدود در زمینه‌ی پاتولوژی دارند. دیگران نشان داده‌اند که DNA استخراج‌شده از باقت‌های FFPE احتمالاً کیفیت پایینی دارد که می‌تواند منجر به اینجاد نتایج مثبت و منفی کاذب به دلیل عدم تثبیت و یا تثبیت بیش‌از‌حد بافت شود [۲۹]. این می‌تواند منجر به ایجاد نتایج منفی کاذب شود که پیامدهای ناخواسته‌ای برای درمان بیمار با استفاده از مهارکننده‌های گیرنده‌های تایروزین کینازی دارد [۱۷]. برای حذف نتایج منفی کاذب، این گزارش از PCR کمّی حساس چندگانه و مخصوص برای الل جهت تشخیص جهش‌ها در کدون‌های ۱۲ و ۱۳ ژن KRAS همزمان با تشخیص DNAهای مرجع جهش‌نیافته در امپلکون‌های کنترل استفاده کرد [۲۲].
معمولاً، نتایج مثبت کاذب به واکنش‌های ضربدری (برای مثال، آلوده شدن نمونه‌ها) در مراحل تخلیص و یا پردازش FFPE مربوط هستند. با این حال، این مشکل در PCR مخصوص برای الل که بر اساس عملکرد ضعیف Taq در شرایطی که پرایمرها اتصال مناسبی ندارد تبیین شد، حذف می‌‌شود. با توجه به این که پلیمراز Taq در مراحل پایین‌تری در موارد اتصال ناجور با پرایمر آغاز به فعالیت می‌کند، پرایمرهای KRAS برای توالی‌های جهش‌یافته، گاهی به توالی‌های جهش‌نیافته متصل می‌شوند که این امر نتایج مثبت کاذیت با مقادیر بالای Cq ایجاد می‌کند [۳۰]. بنابراین، در این مطالعات، نتایج PCR مخصوص برای الل، در تست‌های تأیییدی ما، برای مقادیر Cq زیر ۴۴ مثبت در نظر گرفته شده‌اند. اگرچه یک تست‌ مشابه یگانه گرازش شد [۲۲]، این رویکرد نیاز به هفت تست‌ PCR مخصوص برای الل متفاوت داشت و منجر به مصرف DNA الگو و واکنشگرهای Taqman بیشتر پیش از ردیابی جهش می‌شد. بر خلاف این، تست چندگانه‌ی ما به شکل همزمان ه پرایمر جهش‌یافته و کاوشگر را در یک لوله‌ی آزمایش آنالیز می‌کند و مواد مورد نیاز جهت آزمایش را کاش می‌دهد که این امر در موارد استفاده از بافت‌های FFPE که در آن‌ها میزان DNA جهش‌یافته در مقایسه با DNA سالم کم است، اهمیت دارد [۲۲، ۳۱، ۳۲]. با این که اخیراً یک تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل با استفاده از روش استاندارد PCR نقطه‌ی پایانی و لکه‌گذاری ژل اسید نوکلئیک به وسیله‌ی رنگ سایبر سبز یک برای شناسایی جهش‌های KRAS در نمونه‌های بالینی به کار گرفته شد [۱۰]، این روش نیازمند دستکاری‌های پس از PCR است که همواره خطر آلوده شدن نمونه‌های آزمایشگاهی را بالا می‌برد، چرا که شامل یک روش PCR نقطه‌ی پایانی و پس از آن، جداسازی به وسیله‌ی الکتروفورز برای شناخت محصولات ۶۴ یا ۶۸ جفت‌بازی است که با جهش‌های G12S و G12V (به ترتیب) در ژن KRAS هم‌خوانی دارند. اگر چه این محصولات کوتاه ممکن است حقیقی باشند [۱۰]، در برخی نمونه‌ها ممکن است حاصل تکثیر محصولات جانبی PCR نقطه‌ی پایانی با وزن کم باشند، به ویژه که به وجود هیچ کاوشگر اختصاصی KRAS اشاره نشده است [۱۰]. همچنین، آنالیز الکتروفورزی رنگ سایبر سبز یک که استفاده شده است، منجر به محدودیت این روش در مطالعات پُرداده می‌شود. بر خلاف این، روش چندگانه‌ی مخصوص برای الل ما نه تنها بالقوه می‌تواند نسخه‌های کمیاب DNA جهش‌یافته را ردیابی کند، بلکه استفاده از کاوشگرهای فلورسنت منجر به افزایش حساسیت، اختصاصی بودن و تکرارپذیری آزمایش می‌شود.
این تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل می‌تواند اجازه‌ی غربالگری سریع، ارزان‌قیمت و پُرداده‌ی جهش‌های شایع ژن KRAS را در یک مرحله، با استفاده از هفت پرایمر اختصاصی برای الل‌ها (G12D، G12A، G12R، G12C، G12S، G12V و G13D)، پرایمر‌های شایع Reverse و کاوشگر TaqMan بدهد. بر خلاف گزارش‌هایی که از پلازمید DNA ژن KRAS استفاده کرده‌اند [۱۰، ۲۱] تا حساسیت تست را بسنجند، این تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل با استفاده از DNA انسانی مرجع که از نمونه‌های بالینی و یا سل‌لاین‌های سرطانی گرفته شده‌اند استاندارد شد و توانایی تشخیص چندگانه‌ی حداقل ۰.۱۵٪DNA جهش‌یافته (تقریباً ۲۵ پیکوگرم، معادل ۵ کپی از DNA جهش‌یافته‌ی KRAS) را نشان داد. ردیابی اولیه‌ی جهش‌ها در این روش چندگانه، شناسایی اختصاصی هر جهش را با استفاده از تست‌های جداگانه‌ی مخصوص برای هر الل به دنبال دارد. کیت Cobas KRAS که به لحاظ تجاری قابل تهیه است حساسیتی کم‌تر از ۵٪ برای تشخیص جهش‌های KRAS در کدون‌های ۱۲/۱۳ و کدون ۶۱ دارد. از طرف دیگر، تست PCR تراسکرین RGQ برای ژن KRAS بر اساس گزارش‌ها حساسیت ۱٪ برای تشخیص جهش‌ها در پلازمیدها و سل‌لاین‌ها از خود نشان می‌دهد و هفت جهش در کدون ۱۲/۱۳ شناسایی می‌کند [۳۳]. دیگران اشاره کرده‌اند که کیت PCR تراسکرین RGQ (کیاژن) یا Cobas KRAS (TaqMelt PCR) گران‌قیمت هستند و هزینه به ازای هر نمونه هم به نوع کیت مورد استفاده و هم به کشوری که کیت در آن فروخته می‌شود بستگی دارد. هزینه‌ به ازای هر نمونه برای تست تراسکرین تا سال ۲۰۱۲ برابر بود با ۱۴۳ دلار آمریکا در ایالات متحده آمریکا و این هزینه کم‌تر نشده است. در استفاده از تست Cobas KRAS، هزینه‌ به ازای هر نمونه برابر است با ۹۵ دلار آمریکا و علاوه بر این، تجهیزاتی به جز آن چه برای PCR زمان واقعی نیاز است نیز باید تهیه شود. هزینه‌ی بالا منجر به سختی استفاده از این کیت در فرایندهای بالینی معمولی با تعداد نمونه‌های زیاد می‌شود [۳۴]. دیگر محدودیت‌های مهم برای استفاده از این کیت‌ها، نیازمندی آن‌ها به غلظت‌های بالای ابتدایی DNA است. کیت Cobas KRAS نیازمند ۱۰۰ نانوگرم DNA و کیت تراسکرین نیازمند بین ۱۰۰ تا ۲۰۰ نانوگرم DNA ورودی است، در حالی که تست چندگانه‌ی ما نیازمند ۲۵ نانوگرم DNA در مجموع بود [۳۴]. همچنین، در کشورهای در حال توسعه، هزینه‌ی واردات این کیت‌های آزمایشی، تهیه‌ و استفاده از آن‌ها را مشکل‌تر می‌کند.

معنا‌داری
جهش‌های نابرابر KRAS ممکن است ارزش‌های پیش‌بینی‌کننده‌ی متفاوتی داشته باشند [۲۸، ۳۰]. با این که تست ما جهش‌هایی در KRAS موجود در اگزون ۲، کدون ۱۲ و ۱۳ با حساسیت کمتر یا برابر ۰.۱۵٪ شناسایی کرد، این تست چندگانه نسبت به شناسایی G12S، G13D و G12C در غلظت‌های پایین DNA جهش‌یافته، تورش داشت. شناسایی جهش G12C در کارسینومای ریه‌ی non-small (NSCL) اهمیت بسیار زیادی دارد، چرا که این جهش در سرطان مذکور بسیار شایع است و هم‌راستایی قابل‌توجهی با پیش‌بینی بیماری و مقاومت به روش‌های درمانی مهار تایروزین کینازی دارد [۳۵]. از طرف دیگر، جهش G13D ممکن است تأثیرات کم‌تر وخیمی پس از درمان با کتاکسیمب در سرطان روده‌ی بزرگ داشته باشد [۳۶، ۳۷]. بر خلاف این، بیمارانی که تومورهای سرطان روده‌ی بزرگ دارای جهش‌های KRAS در موقعیت‌های G12V یا G12A دارند، دارای کم‌ترین بقا بودند [۳۱، ۳۲، ۳۵]. در مجموع، تست ما می‌تواند برای شناسایی جهش‌های KRAS در سرطان روده‌ی بزرگ یا کارسینومای ریه‌ی non-small استفاده شود [۳۷، ۳۸، ۳۹].