دانلود رایگان ترجمه مقاله تشخیص مولتی پلکس بهینه ۷ جهش (Plos سال ۲۰۱۶)

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

حساسیت تست‌ چندگانه‌ی مخصوص برای الل
برای تعیین پایین‌ترین دقت محدوده‌ی تشخیص در تست‌ چندگانه‌ی مخصوص برای الل، DNA جهش‌یافته‌ی KRAS با DNA طبیعی مخلوط شد. میزان DNA جهش‌یافته به مرور کم‌تر و کم‌تر شد تا به کسرهای ۵٪، ۲.۵٪، ۱.۲۵٪، ۰.۶۲٪، ۰.۳۲٪ و ۰.۱۵٪ برسد. واکنش‌ها در قالب سه‌تایی و به همراه یک کنترل منفی انجام شدند.

نتایج
ژنوتایپینگ چندگانه‌ی مخصوص برای الل برای ژن KRAS
ما یک تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل طراحی کردیم که هدف آن غربالگری هفت جهش شایع برای KRAS در کدون‌های ۱۲ و ۱۳ در سرطان کارسینومای روده‌ی بزرگ است و در این راستا از تست PCR کمّی مخصوص برای الل استفاده کردیم (شکل ۱). مرحله‌ی اول شامل یک امپلیکون مرجع بدون جهش بود (واکنش کنترل) که همزمان با تست‌های چندگانه‌ی مخصوص برای الل انجام شد. پس از آن، یک تست تأییدی انجام دادیم که نتایجی تکرارپذیر و بدون اختلاط پرایمرهای مخصوص برای الل‌ها به دست می‌داد. شکل ۲ واکنش‌های تکثیری برای تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل و DNA هر یک از هفت جهش شایع در KRAS را نشان می‌دهد. مقادیر ΔCq در جدول ۱ نشان‌ داده‌ شده‌اند. همچنین، پرایمرهای مخصوص برای الل تنها الگوهای دارای توالی خاص را تکثیر کردند، چرا که PCR کمّی با استفاده از پرایمر مخصوص برای G12S، DNA مربوط به G12V را تکثیر نکرد (شکل ۳).

بررسی جهش ژنتیکی در KRAS با استفاده از نمونه‌های کارسینومای روده‌ی بزرگ
تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل که بر روی ۳۲ نمونه‌ی FFPE سرطان روده‌ی بزرگ انجام شد، در ۲۱ نمونه جهش شناسایی کرد. نمودارهای تکثیر در شکل ۴ نشان داده شده‌اند. واکنش‌ها در قالب سه‌گانه انجام شدند و انحراف‌های معیار منفی و مثبت برای مقادیر ΔCt در جدول ۲ نشان داده‌ شده‌اند. مقایسه‌ی تست‌های چندگانه‌ی مخصوص برای الل و توالی‌یابی سنگر در جدول ۲ ارائه شده است. در این مطالعه به وسیله‌ی PCR کمّی، ما به این نتیجه رسیدیم که ۲۲ از ۳۰ مورد که برای ژن KRAS بررسی شدند، محصولات قابل تکثیر PCR به دست دادند. ۶ مورد با استفاده از روش سنگر هیچ محصول قابل تکثیری به دست نداد، اما با استفاده از تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل،در KRAS جهش نشان داد. این ناهماهنگی بین تست چندگانه و روش سنگر، احتمالاً به دلیل بالا بودن کسر سلول‌های غیرتوموری و حساسیت بالاتر تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل است. در ۸ نمونه، هیچ محصول قابل تکثیری در پی روش سنگر و یا تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل به دست نیامد. ۷ نمونه از این نمونه‌ها، از درمان‌گاه‌های عمومی محلی گرفته شده و احتمالاً به دلیل پردازش نامناسب، متحمل تخریب و واسرشتی DNA شده بودند [۱۷]. این باور به این دلیل است که هیچ تکثیری در مورد این نمونه‌ها دیده نشد. در هر ۸ نمونه، نمونه‌های منفی سه بار با هر دو روش توالی‌یابی سنگر و تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل آزمایش شدند. نمونه‌های دیگر به دلیل عدم توانایی تکثیر امپلیکون جهش‌نیافته، تخریب‌شده انگاشته شدند.

حساسیت تست چندگانه‌ی PCR کمّی برای KRAS
برای اندازه‌گیری حساسیت و اختصاصی بودن تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل، DNAهای استاندارد مرجع که دارای ‌KRAS جهش‌یافته بودند رقیق شدند و با DNA مرجع مخلوط شدند. غلظت DNA جهش‌یافته به مرور کم‌تر و کم‌تر شد تا نسبت DNA جهش یافته به DNA سالم کم‌تر شود. ما می‌توانیم در تست چندگانه‌ تا ۰.۱۵٪(برابر با ۳۵ پیکوگرم) از ‌DNA جهش‌یافته را تشخیص دهیم. مثال‌های نماینده‌ی تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل با استفاده از جهش G12S در DNA ژن KRAS در شکل ۱ بخش تکمیلی مقاله نشان داده شده‌اند. برای سنجش حساسیت تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل، جهش‌های KRAS در مخلوط DNA شامل DNA جهش‌یافته و طبیعی با کسرهای گوناگون (۵٪، ۲.۵٪، ۱.۲۵٪، ۰.۶۲٪، ۰.۳۲٪ و ۰.۱۵٪) مقدارسنجی شدند. نتایج به گونه‌ای تکرارپذیر، خبر از وجود مقادیر مقایسه‌پذیر الل‌های جهش‌یافته‌ی KRAS در همه‌ی دفعات آزمایش دادند. میانگین انحراف معیار مثبت و منفی برای ΔCq که در جدول ۳ نشان داده شده‌اند به وضوح ردیابی جهش‌های شایع KRAS را ممکن ساختند. با این حال، در غلظت‌های پایین‌تری DNA جهش‌یافته، تست چندگانه‌ی ما بیشتر G12S، G13D و G12C را ردیابی کرد.

بحث
با توجه به این که جهش‌های KRAS با مقاومت به روش‌های علیه EGFR (به وسیله‌ی کتاکسیمب و پانیتومامب) هم‌راستایی نشان می‌دهد، نیاز به تست‌های سریع، ارزان‌قیمت و پُرداده حس می‌شود که جهش‌های KRAS را در نمونه‌های بالینی تشخیص دهند. روش‌های توالی‌یابی نسل بعد (NGS) به شدت توصیه می‌شوند، اما استفاده از آن‌ها فراتر از توانایی مالی و تخصصی آزمایشگاه‌های بالینی معمولی است. با این که توالی‌یابی به روش سنگر استاندارد طلایی برای شناسایی جهش‌های DNA محسوب می‌شود، حساسیت پایین آن نیاز به درصدهای بالاتری از سلول‌های توموری (برای مثال، ۱۰ تا ۳۰٪) به دلیل اتصالات ضربدری DNA و یا تخریب DNA به وسیله‌ی فرمالین و یا میزان کم توالی هدف، ایجاد می‌کند [۲۷، ۲۸].
در جدول ۲، برخی نمونه‌های FFPE هم در تست چندگانه‌ی ما و هم در روش توالی‌یابی سنگر نتیجه‌ای به دست ندادند. بافت‌هایی که قادر به تکثیر DNA جهش‌نیافته‌ی کنترل نبودند، از درمان‌گاه‌های محلی گرفته شدند که امکانات و تخصصی محدود در زمینه‌ی پاتولوژی دارند. دیگران نشان داده‌اند که DNA استخراج‌شده از باقت‌های FFPE احتمالاً کیفیت پایینی دارد که می‌تواند منجر به اینجاد نتایج مثبت و منفی کاذب به دلیل عدم تثبیت و یا تثبیت بیش‌از‌حد بافت شود [۲۹]. این می‌تواند منجر به ایجاد نتایج منفی کاذب شود که پیامدهای ناخواسته‌ای برای درمان بیمار با استفاده از مهارکننده‌های گیرنده‌های تایروزین کینازی دارد [۱۷]. برای حذف نتایج منفی کاذب، این گزارش از PCR کمّی حساس چندگانه و مخصوص برای الل جهت تشخیص جهش‌ها در کدون‌های ۱۲ و ۱۳ ژن KRAS همزمان با تشخیص DNAهای مرجع جهش‌نیافته در امپلکون‌های کنترل استفاده کرد [۲۲].
معمولاً، نتایج مثبت کاذب به واکنش‌های ضربدری (برای مثال، آلوده شدن نمونه‌ها) در مراحل تخلیص و یا پردازش FFPE مربوط هستند. با این حال، این مشکل در PCR مخصوص برای الل که بر اساس عملکرد ضعیف Taq در شرایطی که پرایمرها اتصال مناسبی ندارد تبیین شد، حذف می‌‌شود. با توجه به این که پلیمراز Taq در مراحل پایین‌تری در موارد اتصال ناجور با پرایمر آغاز به فعالیت می‌کند، پرایمرهای KRAS برای توالی‌های جهش‌یافته، گاهی به توالی‌های جهش‌نیافته متصل می‌شوند که این امر نتایج مثبت کاذیت با مقادیر بالای Cq ایجاد می‌کند [۳۰]. بنابراین، در این مطالعات، نتایج PCR مخصوص برای الل، در تست‌های تأیییدی ما، برای مقادیر Cq زیر ۴۴ مثبت در نظر گرفته شده‌اند. اگرچه یک تست‌ مشابه یگانه گرازش شد [۲۲]، این رویکرد نیاز به هفت تست‌ PCR مخصوص برای الل متفاوت داشت و منجر به مصرف DNA الگو و واکنشگرهای Taqman بیشتر پیش از ردیابی جهش می‌شد. بر خلاف این، تست چندگانه‌ی ما به شکل همزمان ه پرایمر جهش‌یافته و کاوشگر را در یک لوله‌ی آزمایش آنالیز می‌کند و مواد مورد نیاز جهت آزمایش را کاش می‌دهد که این امر در موارد استفاده از بافت‌های FFPE که در آن‌ها میزان DNA جهش‌یافته در مقایسه با DNA سالم کم است، اهمیت دارد [۲۲، ۳۱، ۳۲]. با این که اخیراً یک تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل با استفاده از روش استاندارد PCR نقطه‌ی پایانی و لکه‌گذاری ژل اسید نوکلئیک به وسیله‌ی رنگ سایبر سبز یک برای شناسایی جهش‌های KRAS در نمونه‌های بالینی به کار گرفته شد [۱۰]، این روش نیازمند دستکاری‌های پس از PCR است که همواره خطر آلوده شدن نمونه‌های آزمایشگاهی را بالا می‌برد، چرا که شامل یک روش PCR نقطه‌ی پایانی و پس از آن، جداسازی به وسیله‌ی الکتروفورز برای شناخت محصولات ۶۴ یا ۶۸ جفت‌بازی است که با جهش‌های G12S و G12V (به ترتیب) در ژن KRAS هم‌خوانی دارند. اگر چه این محصولات کوتاه ممکن است حقیقی باشند [۱۰]، در برخی نمونه‌ها ممکن است حاصل تکثیر محصولات جانبی PCR نقطه‌ی پایانی با وزن کم باشند، به ویژه که به وجود هیچ کاوشگر اختصاصی KRAS اشاره نشده است [۱۰]. همچنین، آنالیز الکتروفورزی رنگ سایبر سبز یک که استفاده شده است، منجر به محدودیت این روش در مطالعات پُرداده می‌شود. بر خلاف این، روش چندگانه‌ی مخصوص برای الل ما نه تنها بالقوه می‌تواند نسخه‌های کمیاب DNA جهش‌یافته را ردیابی کند، بلکه استفاده از کاوشگرهای فلورسنت منجر به افزایش حساسیت، اختصاصی بودن و تکرارپذیری آزمایش می‌شود.
این تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل می‌تواند اجازه‌ی غربالگری سریع، ارزان‌قیمت و پُرداده‌ی جهش‌های شایع ژن KRAS را در یک مرحله، با استفاده از هفت پرایمر اختصاصی برای الل‌ها (G12D، G12A، G12R، G12C، G12S، G12V و G13D)، پرایمر‌های شایع Reverse و کاوشگر TaqMan بدهد. بر خلاف گزارش‌هایی که از پلازمید DNA ژن KRAS استفاده کرده‌اند [۱۰، ۲۱] تا حساسیت تست را بسنجند، این تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل با استفاده از DNA انسانی مرجع که از نمونه‌های بالینی و یا سل‌لاین‌های سرطانی گرفته شده‌اند استاندارد شد و توانایی تشخیص چندگانه‌ی حداقل ۰.۱۵٪DNA جهش‌یافته (تقریباً ۲۵ پیکوگرم، معادل ۵ کپی از DNA جهش‌یافته‌ی KRAS) را نشان داد. ردیابی اولیه‌ی جهش‌ها در این روش چندگانه، شناسایی اختصاصی هر جهش را با استفاده از تست‌های جداگانه‌ی مخصوص برای هر الل به دنبال دارد. کیت Cobas KRAS که به لحاظ تجاری قابل تهیه است حساسیتی کم‌تر از ۵٪ برای تشخیص جهش‌های KRAS در کدون‌های ۱۲/۱۳ و کدون ۶۱ دارد. از طرف دیگر، تست PCR تراسکرین RGQ برای ژن KRAS بر اساس گزارش‌ها حساسیت ۱٪ برای تشخیص جهش‌ها در پلازمیدها و سل‌لاین‌ها از خود نشان می‌دهد و هفت جهش در کدون ۱۲/۱۳ شناسایی می‌کند [۳۳]. دیگران اشاره کرده‌اند که کیت PCR تراسکرین RGQ (کیاژن) یا Cobas KRAS (TaqMelt PCR) گران‌قیمت هستند و هزینه به ازای هر نمونه هم به نوع کیت مورد استفاده و هم به کشوری که کیت در آن فروخته می‌شود بستگی دارد. هزینه‌ به ازای هر نمونه برای تست تراسکرین تا سال ۲۰۱۲ برابر بود با ۱۴۳ دلار آمریکا در ایالات متحده آمریکا و این هزینه کم‌تر نشده است. در استفاده از تست Cobas KRAS، هزینه‌ به ازای هر نمونه برابر است با ۹۵ دلار آمریکا و علاوه بر این، تجهیزاتی به جز آن چه برای PCR زمان واقعی نیاز است نیز باید تهیه شود. هزینه‌ی بالا منجر به سختی استفاده از این کیت در فرایندهای بالینی معمولی با تعداد نمونه‌های زیاد می‌شود [۳۴]. دیگر محدودیت‌های مهم برای استفاده از این کیت‌ها، نیازمندی آن‌ها به غلظت‌های بالای ابتدایی DNA است. کیت Cobas KRAS نیازمند ۱۰۰ نانوگرم DNA و کیت تراسکرین نیازمند بین ۱۰۰ تا ۲۰۰ نانوگرم DNA ورودی است، در حالی که تست چندگانه‌ی ما نیازمند ۲۵ نانوگرم DNA در مجموع بود [۳۴]. همچنین، در کشورهای در حال توسعه، هزینه‌ی واردات این کیت‌های آزمایشی، تهیه‌ و استفاده از آن‌ها را مشکل‌تر می‌کند.

معنا‌داری
جهش‌های نابرابر KRAS ممکن است ارزش‌های پیش‌بینی‌کننده‌ی متفاوتی داشته باشند [۲۸، ۳۰]. با این که تست ما جهش‌هایی در KRAS موجود در اگزون ۲، کدون ۱۲ و ۱۳ با حساسیت کمتر یا برابر ۰.۱۵٪ شناسایی کرد، این تست چندگانه نسبت به شناسایی G12S، G13D و G12C در غلظت‌های پایین DNA جهش‌یافته، تورش داشت. شناسایی جهش G12C در کارسینومای ریه‌ی non-small (NSCL) اهمیت بسیار زیادی دارد، چرا که این جهش در سرطان مذکور بسیار شایع است و هم‌راستایی قابل‌توجهی با پیش‌بینی بیماری و مقاومت به روش‌های درمانی مهار تایروزین کینازی دارد [۳۵]. از طرف دیگر، جهش G13D ممکن است تأثیرات کم‌تر وخیمی پس از درمان با کتاکسیمب در سرطان روده‌ی بزرگ داشته باشد [۳۶، ۳۷]. بر خلاف این، بیمارانی که تومورهای سرطان روده‌ی بزرگ دارای جهش‌های KRAS در موقعیت‌های G12V یا G12A دارند، دارای کم‌ترین بقا بودند [۳۱، ۳۲، ۳۵]. در مجموع، تست ما می‌تواند برای شناسایی جهش‌های KRAS در سرطان روده‌ی بزرگ یا کارسینومای ریه‌ی non-small استفاده شود [۳۷، ۳۸، ۳۹].