مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

این مطالعه یک سیستم شناسایی ارائه می کند که از CNN استفاده می کند تا بتواند حالت های غیر عادی در ماموگرافی ها را شناسای کرده و آن ها را تشخیص دهد. به صورت عمومی، یک ماموگرام به صورت نرمال، خوش خیم و یا بدخیم دسته بندی می شود (شکل 1 یک مثال را نشان میدهد).
دو گام آخر در شبکه های عمقی عصبی انجام می شود که هر دو قسمت استخراج ویژگی و دسته بندی آن ها را به صورت خودکار انجام می دهد. این مقاله به صورت زیر دسته بندی شده است. یک مرور نسبت به کار های مرتبط در بخش 2 ارائه شده است. بخش 2 روش ما برای پردازش داده ها را مطرح کرده و معماری CNN را نمایش می دهد. در بخش 4، ما نتایج کار خودمان را ارائه می کنیم. در نهایت، در بخش 5 نیز ما یک جمع بندی از مطالعه را همراه با مباحث عمومی نسبت به نتایج به دست آمده را ارائه می کنیم.

2. کارهای مرتبط
تمام زنان ممکن است تحت تاثیر سرطان پستان قرار بگیرند .سرطان پستان دلیل اول مرگ زنان می باشد. در نتیجه، مطالعه های مختلفی انجام شده است تا ابزاری توسعه پیدا کنند که بتوان از آن ها برای تشخیص این بیماری های سرطانی استفاده کرد. سیستم های شناسایی خودکار سرطان پستان با استفاده از تکنیک های مختلف یادگیری ماشینی (ML) توسعه پیدا کرده اند.
در سال 2008، ورما یک روش برای دسته بندی تصویر های ماموگرافی را ارائه کرد که به هدف شناسایی سرطان پستان مورد استفاده قرار می گرفت. روش پیشنهاد شده مبنی بر قرار دادن نورون های جدید در لایه های پنهان شبکه می باشد. نرخ دسته بندی در این روش 94% بود.
در سال 2016 سعید و همکارانش از تصویر های رزونانس مغناطیسی استفاده کردند تا ویژگی ها را برای دسته بندی تصویر های ماموگرافی در دو دسته، استخراج کنند: بدخیم، خوش خیم. آن ها در مطالعه خودشان از الگوریتم های KNN و LDA استفاده کردند.
همچنین در سال 2016، ژنگ و کی و همکارانش، از الگوریتم های یادگیری بدون سرپرست استفاده کردند: ماشین بلتزمن محدود (RBM) و ماشین بلتزمن با درگاه نقطه ای (PGBM) با استفاده از یادگیری عمقی در این مطالعه ها مورد استفاده قرار گرفت تا ویژگی های تصاویر برای دسته بندی سرطان پستان استخراج شود. صحت به دست آمده در این مطالعه ها 93.4% بود.
همچنین در سال 2016، سیدنی و لیما از دو نوع مختلف از داده ها یعنی تصاویر و بافت استفاده کردن تا بتوانند ویژگی های هر نوع از داده ها را با استفاده از لحظات زرنیک و موجک هایی با چند تفکیک به دست بیاورند. روش به دست آمده نتایج SVM و ELM را برای دسته بندی سرطان پستان با صحت 94.11% ترکیب می کند.

در سال 2017، الهرابی و تچیر یک سیستم خودکار را برای شناسایی کردن سرطان پستان ارائه کردن که مبتنی بر دیتابیس عربستان سعودی بود و نتایج الگوریتم های ژنتیک و فازی را با یکدیگر ترکیب کردند.
این روش ها که در قسمت بالا توصیف شدند نیازمند یک گام اساسی برای استخراج ویژگی های تصویر قبل از گام شناسایی می باشند و نمی توان به صورت زمان واقعی از آن ها استفاده کرد. بر اساس دانش ما، این کار اولین کار است که از شبکه های عصبی پیچه ای برای سیستم های تشخیص کامپیوتری استفاده می کند که برای سرطان پستان مورد استفاده قرار می گیرند. این کار، در ادامه وظایف قبلی انجام شده است.

3. روش پیشنهاد شده
ایجاد کردن شبکه ها با روش پیشنهاد شده که در شکل 2 نشان داده شده است، بعد از چند آزمایش و یک مطالعه دقیق نسبت به مقالات برای دیگر روش های دسته بندی، محقق شد. یک گام اولیه برای دسته بندی دستی در دیتابیس نیز برای به دست آوردن جرم های مختلف، انجام شد.

3.1. دسته بندی
در روش ما، یک دسته بندی دستی از جرم در بیس یادگیری (بیس ما شامل تصویر های جرمی می باشد که یک دایره قرمز دور آن ها کشیده شده است) انجام می شود تا بتوان کانتور ها را به دست آورد تا با استفاده از تحلیل ImageJ آن ها را تحلیل کرد( شکل 3 نشان دهنده یک نمونه می باشد).

3.2. معماری CNN و تشخیص آن
ما از 6 لایه در معماریCNN خودمان استفاده می کنیم که به صورت زیر سازمان دهی شده است: لایه پیچه ایCI، لایه نمونه برداری S1، لایه پیچه ای C2، لایه نمونه برداری S2، لایه متراکم D و در نهایت لایه خروجی O (شکل 2). پارامتر های اصلی این مدل و اطلاعات تمرین در معماری CNN پیشنهاد شده در شکل 4 توصیف شده اند.

استفاده از سونوگرافی حین عمل در جراحی ستون فقرات

Use of Intraoperative Ultrasound During Spinal Surgery

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب)

F1952

ما از دستگاه سونوگرافی سیار Aloka Prosound Alpha 5 (Hitachi، Wallingford، CT) برای انجام سونوگرافی در طول عمل جراحی ستون فقرات استفاده کرده ایم. به طور کلی، ما دریافته ایم که استفاده از پروب مبدل Aloka UST-9120 (Hitachi، Wallingford، CT) که دارای یک قطر 20 میلی متر است و دامنه فرکانس 4 تا 4. 4 مگاهرتز را ارائه می دهد، بیشترین سازگاری را با مشخصات ما دارد. تعدادی دستگاه قابل مقایسه در بازار وجود دارند و ما استفاده از هر دستگاه سونوگرافی مدرن همراه با مبدل های اختصاصی را توصیه می کنیم. پس از برداشتن کامل استخوان و بیرون آمدن نخاع، حوزه جراحی باید با محلول شور برای تزویج آکوستیک پر شود. پس از آن، پروب سونوگرافی باید در داخل حمام شور قرار داده شود تا تصاویر را در هر دو صفحه عرضی و طولی حاصل نماید. لمس نخاع یا نخاع شوکی را با پروب به منظور به دست آوردن تصاویر لازم نیست.در سونوگرافی، نخاع به عنوان یک غشای اکوژنیک در اطراف یک فضای مایع نخاعی بدون انعکاس ظاهر می شود. نخاع شوکی درون نخاع واقع شده است و به عنوان یک ساختار همگن با انعکاسات کم احاطه شده توسط لبه اکوژنیک ظاهر می شود که نشان دهنده تغییر فیزیکی چگالی از مایع نخاعی تا نخاع شوکی بافت اصلی است. همچنین یک انعکاس مرکزی روشن وجود دارد که کانال مرکزی را نمایان می کند. ريشه های عصبی خارج شونده به طور چشمگيري اکوژنيک هستند و به طور خاص در سندرم دم اسب ظاهر مي شوند.

ضایعات توده درون نخاعی

در تجربه ما، سونوگرافی در طی عمل ثابت شده است که در طول جراحی برای آسیب شناسی درون نخاعی بسیار مفید است. نویسنده ها قبلاً استفاده از سونوگرافی برای برداشتن ضایعات درون نخاعی مانند تومورها و غارمانند، ضایعات بیرون نخاعی مانند کیست های پس از قاعدگی، قرار دادن شریان های سارینگو-سوباراروآنیوئید و همچنین دفع فیستول های شریانی آئروهیدروهال دوقطبی ستون فقرات را گزارش داده اند. به به طور معمول، هنگام آماده شدن برای عمل جراحی درون نخاعی ، مواجهه استخوانی بر اساس یک CT یا MRI قبل از عمل برنامه ریزی می شود. پس از آن یک دوروتومی تقریبا توسط تقریب جایی که ضایعه باید براساس نشانه های مجاور باشد ایجاد می شود. هنگامی که ضایعه به نظر می رسد، ممکن است دوروتومی نیاز به طویل شدن در جهت جمجمه ای یا دمی داشته باشد تا از مواجهه کافی اطمینان حاصل شود. ضایعات درون نخاعی بیرون نخاعی در سندروم دم اسبی می تواند در مقایسه با تصویربرداری قبل از عمل جراحی به طور شاخکی حرکت کند، که گاهی اوقات موقعیت یابی آنها را دشوار می سازد. اما اگر از سونوگرافی استفاده شود، ضایعه را می توان به صورت بصری مشخص نمود، در حالی که نخاع هنوز دست نخورده است و باز شدن نخاعl می تواند دقیقا براساس اندازه و محل ضایعه تنظیم شود. در مقایسه با سیستم های تصویربرداری پیشرفته تر درون عمل مانند cbCT یا iCT، سونوگرافی, تصویربرداری بافت نرم بافت بهتر را از ساختارهای درون نخاعی فراهم می کند. به عنوان مثال، چندین نویسنده گزارش کرده اند که جداسازی ها در کیست های نخاعی می تواند بر روی سونوگرافی تجسم شود، اما نه CT. MRI درون عمل (iMRI) در برخی از موسسات موجود است و تصویربرداری بافت نرم با وضوح بسیار بالاتر را ارائه می دهد. با این حال، استفاده از این فن آوری گران ، وقت گیر و برای بسیاری از آسیب شناسی داخلی, غیرضروری است ، به خصوص در مقایسه با سونوگرافی عملیاتی، که به طور گسترده در دسترس است، ارزان است، و می تواند در عرض چند دقیقه انجام شود.

ضایعات درون نخاعی, یک چالش بزرگ برای جراح مطرح می کند زیرا برش شامل تشریح از طریق tracts عصبی می شود و یک خطر ذاتی نقص عصبی بعد از عمل برای بیمار وجود دارد. اصول کلی پذیرفته شده در عمل جراحی نخاع درون نخاعی عبارتند از به حداقل رساندن تشریح بافت اصلی نخاعی طبیعی، پیدا کردن صفحات بافت, و برش تنها تومور تا حد ممکن بدون نقص عصبی. استفاده از سونوگرافی درون عمل می تواند به جراح کمک کند تا به طور صحیح و موثر با ارائه اطلاعات در زمان واقعی در مورد ترکیب بافت در طی تشخیص از طریق نخاع, به اهداف برش برسد. در طی عمل جراحی، Gelfoam (Pfizer, New York, NY) را نیز می توان برای تشخیص صفحات بافت و تعریف محدودیت های جداسازی برای ضایعات درون نخاعی مورد استفاده قرار داد. Gelfoam به نظر می رسد در سونوگرافی, فراانعکاسی باشد و امواج صوتی را تضعیف نمی کند، بنابراین می توان آن را در سونوگرافی شناسایی نمود و به عنوان یک نشانگر جراحی استفاده نمود.

نمونه موردی 1: ضایعه گردنی درون نخاعی نزدیک شده از طریق میلوتومی خط میانی

یک مرد 54 ساله بدون سابقه پزشکی قابل توجه با تاریخچه یک ماهه از تب با منشا ناشناخته معرفی شد. اگر چه او از نظر عصبی دست نخورده بود، به عنوان بخشی از کار او، یک MRI ستون فقرات گردن داشت که یک توده بزرگ درون نخاعی در مرکز C6 با سیگنال ناهمگن T2 در سمت پایین و سیگنال مایع را در بالا را با ارتقای بسیار دقیق پس از کنتراست نشان داد (شکل 1). جرم پس از یک ماه از نظارت تصویری، ثابت باقی ماند. برای جستجوی سایر علل احتمالی تب, یک کار گسترده بدون موفقیت انجام شد. با توجه به نیاز به تشخیص قطعی، بیمار به اتاق عمل برای لامینکتومی C5-7 و برداشتن ضایعه منتقل شد. پتانسیل های حرکتی برانگیخته شده (MEPs) و پتانسیل های تحریک شده ی حس بدنی (SSEP) در طول این مورد بدست آمد. بعد از مواجهه با نخاع، سونوگرافی برای موقعیت یابی ضایعه و برنامه ریزی دوروتومی مورد استفاده قرار گرفت (شکل 2). نخاع به شدت در وسط خط باز شد و برگچه های نخاع برای عضلات پاراسپین مجاور بخیه شد. بعد، عنکبوتی با استفاده از گیره های ظرفی باز شد و به نخاع قرارگیرنده متصل شد. خط میانی نخاع توسط مشاهده تخلیه وریدهای جداره ای و با استفاده از ریزتحریک برای شناسایی محل معکوس شدن مرحله SSEPها شناسایی شد. پس از آن نرم شامه به شدت باز شد و یک ریزتشریح کننده برای عمق بخشیدن به تشریح از طریق رافه میانی پشتی استفاده شد. سونوگرافی اغلب برای هدایت مسیر جراحی از طریق نخاع استفاده می شود تا تومور خاکستری تجسم یابد. در قسمت بسیار جمجمه ای تومور، یک کیست به صورت مورد انتظار از MRI قبل از عمل مواجه شد. برای تایید این که این واقعاً جمجمه ای ترین سمت تومور بود، یک قطعه کوچک از Gelfoam در حفره برش گذاشته شد و یک بار دیگر از سونوگرافی استفاده شد تا تأیید شود که این در واقع, حد تومور است (شکل 2). کپسول تومور از نخاع تشریح شد و سپس تومور به صورت جزئی برداشته شد. سونوگرافی برای تشخیص تومور باقی مانده استفاده شد که پس از آن حذف می شود. پس از برش کامل ضایعه، نرم شامه و نخاع بسته شدند. اشاره شد که نمایندگان MEPها و SSEPها در طول این مورد بدون تغییر باقی ماندن. پس از عمل، بیمار به مرحله اولیه عصبی بازگشت. تب او بعد از برداشتن تومور، از بین رفت. تشخیص نهایی پاتولوژیک, اپنادیوموما درجه II سازمان بهداشت جهانی را دریافت کرد و یک ماه پس از آن MRI به دست آمده, یک برش کامل را تایید کرد (شکل 3).

ضایعات شکمی به کیسه تکال
در هنگام رسیدگی به ضایعات واقع شده شکمی به کیسه تکال از یک رویکرد خلفی، به ویژه در ستون فقرات گردن و قفسه سینه که در آن کیسه تکال به راحتی نمی تواند متحرک شود که ناشی از ریسک آسیب نخاعی پزشک زاد است, ما همچنین استفاده از سونوگرافی در عمل جراحی را بسیار مفید یافتیم. گزارش شده است که سونوگرافی درون عمل در برداشتن فتق دیسک بین مهره ای، کاهش شکستگی های پشتی خلفی، برداشتن تومورهای فوق دردناک قرار گرفته و برای تعیین اینکه آیا فشرده سازی خلفی به تنهایی برای درمان کانال نخاعی به دلیل پوکی استخوان رباط طولی خلفی کافیست, مفید است. رویکردهای قدامی برای کانال نخاعی شکمی می تواند راهکار بهتری برای تجسم مستقیم این منطقه را فراهم کند؛ با این حال، روش های فراقفسه سینه ای, قفسه سینه ای-شکمی, و عقب-صفافی با افزایش میزان خونریزی، زمان عمل و مرگ و میر جراحی مرتبط است. این معایب را می توان با استفاده از یک رویکرد خلفی با هدایت سونوگرافی برای مانور دادن ابزارهای زاویه ای زیر کیسه تکال بدون نیاز به منقبض شدن کیسه تکال ، نخاع یا ریشه های عصبی اجتناب نمود.
به عنوان مثال، هنگام رویکرد به دیسک قفسه سینه ای آهکی طریق یک رویکرد تشریح ساقه اصلی خلفی، یک آلت تراش جراحی زاویه دار را می توان با خیال راحت و کیسه تکال تحت تجسم سونوگرافی به منظور آزادسازی کانال قرار داد. به همین ترتیب، در مورد شکستگی پشت سر هم قفسه سینه ای-کمری ، سونوگرافی درون عمل را می توان برای شناسایی قطعات استخوانی حمله کننده به کانال و یک ضربه گیر بوت شکل مورد استفاده قرار داد یا قلاب جراحی اصلاح شده را می توان کیسه تکال به منظور کاهش شکستن قرار داد.

نمونه موردی 2: فتق دیسک قفسه سینه قابل تشخیص با رویکرد ترنس فاکت ساقه اصلی
یک زن 73 ساله با سابقه چند ماهه اختلال در رفت و آمد، تشنج، و بی حسی اندام تحتانی. در مورد معاینه عصبی، هیچ ضعفی در موتور وجود نداشت، اما به نظر می رسید که بسیار میوپاتیک با کلونوس مشخص شده، رفلکس های کششی عضلانی 4+ و راه رفتن با شدت زیاد است. CT و MRI, یک فتق دیسک بزرگتر و بدون انسداد T10-11 را با فشردگی نخاعی نشان داد (شکل 4). او تحت یک hemiمهره برداری سمت-راستی T10-11، فاکتومی و ریزتشریح ساقه اصلی و همجوشی T9-11 قرار گرفت. پس از اینکه نخاع طی عمل جراحی قرار گرفت، سونوگرافی درون عمل برای تشخیص فتق دیسک (تصویر 5A) استفاده شد. سپس یک دیسک حلقه ای با یک چاقوی کالبدشکافی باز شد و یک رانژر (کندن قطعات استخوان) مخاطی برای ایجاد حفره ی مرکزی استفاده شد. سپس یک آلت تراش جراحی زاویه دار رو به پایین به دقت به صورت شکمی به کیسه تکال قرار داده شد و برای هل دادن قطعات دیسک فتق قبلاً شناسایی شده در سونوگرافی در فضای دیسک استفاده می شد. این قطعات دیسک پس از آن دوباره با یک رانژر (کندن قطعات استخوان) مخاطی برداشته شد. سونوگرافی به طور مرتب برای ارزیابی فشارخون مورد استفاده قرار گرفت و این روند تا زمانیکه کل فتق دیسک قطع شد (شکل 5B) تکرار شد. بدون استفاده از سونوگرافی، ممکن است که قطعات دیسک فشرده ممکن است پشت سر گذاشته شود. بعد از عمل، او به حالت اولیه مغز و اعصاب بازگشت و با پیگیری 1 ماهه تمام علائم قبل از عمل او حل شدند.

نمونه موردی 3: کاهش شکستگی کمری کمری
یک زن 57 ساله با سابقه سرطان متاستاتیک آپاندیس با درد پایین مکانیکی و درد ران قدامی سمت چپ مزمن-آغازین. یک ماه قبل, او تحت کیفوپلاستی بالون در L1 و L2 تحت درمان شکستگی های فشرده سازی پاتولوژیک قرار گرفت. در معاینه، او کمبودهای حرکتی نداشت، اما مشخص شد که دارای احساس کاهش یافته به لمس نور در ران چپ خود است. یک MRI انجام شد که نشان دهنده شکستگی پریشانی L2 پشت سر هم بود (شکل 6). او بعد از ظهر روز بعد به اتاق عمل برده شد, که در آنجا تحت مهره برداری L1-L2، کاهش فراشپشی سمت چپ شکستگی و ترکیب خلفی-جانبی T12-L3 قرار گرفت. بعد از تکمیل مهره برداری ، ساقه اصلی سمت چپ L2 با عمل جراحي مهره اي دریل شد. دیده شد که ریشه عصب L2 بر روی یک قطعه استخوانی شل با پارچه پوشانیده شد که برداشته شد. این حوزه با محلول شور برای تزویج آکوستیک و سونوگرافی برای بررسی کیسه تکال استفاده شد. با استفاده از سونوگرافی، ما یک قطعه بزرگ استخوان در کانال نخاعی شکمی را پیدا کردیم که ساقه عضله را جابجا کرد، که نمی توان مستقیماً تجسم کرد (شکل 7A). برای کاهش این قطعه مجزا، یک ضربه گیر بوت شکل استفاده شد. سپس سونوگرافی دوباره برای تأیید آزاد شدن کافی (شکل 7B) به حوزه بازگشت. بعد از عمل، بیمار با بهبود علائم و نشانه های بیماری عصبی خود بازگشت و چندین روز بعد مرخص شد.

نتیجه گیری
اگرچه سونوگرافی یکی از روشهای ابتدایی تجویز تصویر درمانی است که در جراحی ستون فقرات استفاده می شود، اما همچنان مزایای متعددی را نسبت به تکنولوژی های جدیدتر دارد. هنگامی که سونوگرافی عمل جراحی به طور مناسب استفاده شود، اطلاعات ارزشمندی در مورد ساختارهای بافت نرم فراهم می کند که توسط جراح عمل جراحی تجویز نمی شود. بنابراین، تصاویر سونوگرافی می توانند در پرتوی مطالعات MRI قبل از عمل جراحی به منظور کمک به جراح در درک بهتر آناتومی موضعیت تفسیر شوند. نه فلوئوروسکوپی روزمره، cbCT، و نه ICT، رزولوشن کافی بافت نرم را برای این منظور ارائه نمی دهند. علاوه بر این، سونوگرافی تنها راه درست تصویربرداری واقعی در زمان واقعی برای تجسم بافت نرم باقی مانده است. این روش ارزان است، به طور گسترده ای در دسترس است، استفاده از آن آسان است، و بیمار را در معرض اشعه یونیزه قرار نمی دهد. به همین علل، ما معتقدیم که استفاده از سونوگرافی درون عمل باید در طول رویکرد خلفی برای ضایعات درون نخاعی یا ضایعات درون کانال نخاعی شکمی در نظر گرفته شود. استفاده از سونوگرافی و تفسیر تصاویر باید در برنامه های آموزشی اقامت برای جراحی ستون فقرات گنجانده شود.

بیان ژن مرتبط با سلول بنیادی سرطان به عنوان یک بیومارکر بالقوه برای پاسخ به ایمی پریدن ONC201 رده اولی در تومورهای جامد

Cancer stem cell-related gene expression as a potential biomarker of response for first-inclass imipridone ONC201 in solid tumors

Abstract

Cancer stem cells (CSCs) correlate with recurrence, metastasis and poor survival in clinical studies. Encouraging results from clinical trials of CSC inhibitors have further validated CSCs as therapeutic targets. ONC201 is a first-in-class small molecule imipridone in Phase I/II clinical trials for advanced cancer. We have previously shown that ONC201 targets selfrenewing, chemotherapy-resistant colorectal CSCs via Akt/ERK inhibition and DR5/TRAIL induction. In this study, we demonstrate that the anti-CSC effects of ONC201 involve early changes in stem cell-related gene expression prior to tumor cell death induction. A targeted network analysis of gene expression profiles in colorectal cancer cells revealed that ONC201 downregulates stem cell pathways such as Wnt signaling and modulates genes (ID1, ID2, ID3 and ALDH7A1) known to regulate self-renewal in colorectal, prostate cancer and glioblastoma. ONC201-mediated changes in CSC-related gene expression were validated at the RNA and protein level for each tumor type. Accordingly, we observed inhibition of self-renewal and CSC markers in prostate cancer cell lines and patient-derived glioblastoma cells upon ONC201 treatment. Interestingly, ONC201-mediated CSC depletion does not occur in colorectal cancer cells with acquired resistance to ONC201. Finally, we observed that basal expression of CSC-related genes (ID1, CD44, HES7 and TCF3) significantly correlate with ONC201 efficacy in >1000 cancer cell lines and combining the expression of multiple genes leads to a stronger overall prediction. These proof-of-concept studies provide a rationale for testing CSC expression at the RNA and protein level as a predictive and pharmacodynamic biomarker of ONC201 response in ongoing clinical studies.

1 Introduction

Several clinical studies have demonstrated the relevance of cancer stem cells (CSCs) that clearly correlate with recurrence, metastasis and poor survival in solid tumors [1–3]. Recent objective responses observed in Phase I/II clinical trials of various CSC-targeted agents in a number of advanced refractory solid tumors have further established the importance of CSCs as a therapeutic target [4–6].

The first-in-class small molecule imipridone ONC201 is currently in Phase I/II clinical trials for advanced cancer [7]. The first-in-human Phase I study in advanced solid tumors demonstrated ONC201 to be safe, and exhibit predicted pharmacokinetics, sustained pharmacodynamics and tumor shrinkage [8]. The anti-CSC efficacy of ONC201 has been previously demonstrated in vitro and in vivo in colorectal cancer and acute myeloid leukemia (AML) [9, 10]. ONC201-mediated depletion of chemotherapy-resistant colorectal CSCs involves dual inactivation of Akt and ERK signaling that results in transcription factor Foxo3 activation that leads to DR5/TRAIL-dependent inhibition of self-renewal [9, 11]. In the current study, we evaluated whether the anti-CSC effects of ONC201 involve early changes in stem-cell related gene expression prior to tumor cell death. We examined if ONC201-mediated inhibition of CSCs extends to other solid tumors. Additionally, we tested whether CSC expression can serve as a potential biomarker of ONC201 response.

مقالات انگلیسی و ترجمه های فارسی رایگان با فرمت PDF آماده دانلود رایگان میباشند

همچنین ترجمه مقاله با فرمت ورد نیز قابل خریداری و دانلود میباشد

مقاله انگلیسی رایگان (PDF)

ترجمه فارسی رایگان (PDF)

خرید ترجمه با فرمت ورد

فهرست مقاله:

مقدمه
تاریخچه ای کوتاه
بیوژنز و عملکرد miRNA
miRNA و تنظیم ترجمه
آغاز ترجمه
MiRNAs و سرطان
نتیجه گیری

بخشی از ترجمه فارسی مقاله:

 مقدمه
پیشرفت های اخیر در تحلیل ترانسکریپتوم و فناوری های مولد و پرتون نشان دهنده پیچیدگی بالای دنیای RNA است. شناخته شده ترین مناطق RNA، ژن های کد کننده پروتین، MicroRNAs، می باشند که 1.5 درصد ژنوم انسان را شامل می شوند. اهمیت MicroRNAs کد کننده کاملا شناخته شده است زیرا به مدت سالیان مختلف پایه و اساس زیست شناسی تجربی بوده است و به تشخیص سیستمی ژن های کد کننده در گونه های مختلف انجامیده است. در عین حال رتروترانسپوزون ها، عناصر ژنتیکی به تنظیم بیان ژن کمک می کنند. چون RNA به عنوان مسئله اصلی تنظیم ژنتیکی محسوب می شود، ایده حاوی اطلاعات اساسی به کلاس های جدیدی از RNA توسعه داده شده است. اخیرا، بخش کد کننده غیر پروتینی توجه زیادی را به دلیل نقش غیر منتظره خود در تظیم رشد و بیماری کسب کرده است. امروزهف بیشتر دانشمدان بر این باور هستند که رونویسی ژنوم انسان بسیار وسیع است و این مسئله موجب افزایش سوالاتی در خصوص کارکرد RNA ها می شود.
کشف RNA های غیر کد کننده موجب تغییر شیوه نگرش ما به ژنوم انسان شده و جهان علم را قادر به شناسایی انواع متفاوتی از ncRNAs در سلول های انسانی کرده است. اگرچه یک مرز مشخصی از کلاس های ncRNAs وجود ندارد، آنها بر طبق طول نوکولئوتید شان در سه گروه اصلی طبقه بندی می شوند: ncRNAs های کوتاه، ncRNAs های با اندازه متوسط و ncRNAs های با طول بلند. در میان ncRNAs های کوتاه، می توان بین microRNAs و RNAs (piRNAs) انتخاب کرد و به ترتیب دارای 19 تا 25 جفت باز و 26-31 جفت باز است. miRNAs در تنظیم بیان زن در سطح پایداری و ترجمه نقش دارد، در حالی که piRNAs در متیلاسیون DNA و مهار ترانسپوزون نقش دارد.RNA های هسته ای کوچک، بخشی از RNA های با اندازه متوسط بوده و به عنوان راهنمایی برای اصلاحات Rrna عمل می کند. lncRNAs در چندین فرایند پاتولوژیکی و بیولوژیکی نظیر نقش پذیری ژنومی، تنظیم تلومر، غیر فعال سازی کروموزوم ایکس ، رشد، چند توانی سلول های بنیادی، تنظیم ایمنی، پیشرفت سرطان و پتانسیل متاستاز ایفا می کنند. به طور ویژه، یک زیرمجموعه ای از ncRNAs، T-UCR، میکرو RNA ها را هدف یابی می کنند. ارتباط بین این lncRNAs و microRNAs مانع از تجزیه رونویسی می شود. لازم به ذکر است که تعریف ncRNAs بستگی به ابزار های بیو انفورماتیک دارد که در آینده ای نزدیک به چالش کشیده می شود. به طور ویژه، قالب های باز خواندن کوتاه تر از 100 نوکلوتید و یا فاقد توالی ATG قوی برای شروع ترجمه، به صورت غیر کد کننده در نظر گرفته می شود. از حیث ظهور مکان های شروع ترجمه جایگزین، می توان کشف کرد که حداقل برخی از ncRNAs ها برای پپتید های کوچک کد کننده هستند.
اهمیت ترانسکریپتوم غیر کد کننده در درک بیماری های انسانی با تعداد زیادی از ncRNAs ها که به طور ناهنجار در سرطان، بیماری قلبی و عصبی یا اختلالات ایمنی بیان می شوند برجسته تر می شود. در این رابطه، RNAs های کوچک توجه بسیاری از محققان را جذب کرده است. از این روی ما بر microRNAs و نقش آن ها در تنظیم ترجمه و سرطان تاکید می کنیم. در نهایت ما به بررسی بیان microRNAs در سرطان و پتانسیل آن ها در تولید دارو های جدید می پردازیم.
MicroRNAs: کشف و بیوژنز
تاریخچه ای کوتاه
MicroRNAs ها RNA های تک رشته ای و غیر کد کننده با 19 تا 25 نوکلوتید طول می باشند که هم در جانوران و هم در گیاهان یافت شده و در عین حال در تنظیم رونویسی نقش دارند. دو دهه پیش، وجود microRNAs مبهم بود و جامعه علمی بر ژن های کد کننده پروتین تاکید داشتند.
با این حال در 1993، به مدت هفت سال پس از کشف lin-4 RNA، ژنومیک این نوع RNA تنظیم کننده ساده تر شده است به طوری که هیچ شاهدی برای RNA های شبه lin-4 فراتر از نماتد ها وجود نداشته و علایم RNA های غیر کد کننده مشابه درون نماتد ها وجود نداشته است. این مورد همگی منجر به کشف LET7 شده است که یک ژن دیگر در مسیر هتروکرونیک الگانس بوده و دومین RNA تنظیم کننده 22 نوکلوتیدی را کد گذاری کرده است. let 7 RNA موحب افزایش انتقال و کذار از مرحله اواخر لاروی به سلول های بالغ همانند LIN-4می شود. به علاوه، همولوگ های ژن Let7 در انسان و ژنوم مگس، و let 7 RNA در انسان ، مگس سرکه شناسایی شده است( راسکالینی و همکاران 2000).جهش در این ژن با بر هم زدن نظم در مراحل رشد و نمو، موجب عدم تغییر سلول های جنینی از اولین مرحله لاروی L1 به مراحل بعدی می شود. محققان بر این باورند که از ژن Lin-4 پروتینی سنتز نمی شود و به جای آن دو نوع RNA کوچک ساخته می شود:یک RNA کوتاه 22 نوکلوتیدی Lin-4-s و RNA دیگری که طول بیشتری در حدود 60 نوکلوتید دارد. مطالعات بعدی توسط وایتمن نشان داده است که ژن Lin-4 تنظیم کننده منفی ژن Lin-14 می باشد. ژن اخیر پروتینی با عمر کوتاه تولید می کند و در نمو جنین کرم نقش دارد. نکته جالب، تلاقی زمانی کارکرد تنظیمی و غیر مداوم Lin-4 RNA و با بیان پروتین LIN-14 می باشد. در واقع با حضور Lin-4 RNA، میزان پروتین LIN-14 تا بیست برابر کاهش می یابد. تحقیقات امبروس و راکون نشان داده است که در بخش 3 UTR، در m-RNA ژن Lin-4، قسمت های مختلفی وجود دارند که از نظر توالی مکمل توالی Lin-4 RNA می باشند. هم چنین ادامه تحقیقات نشان داد که اتصال بین این دو مولکول RNA، دلیل اصلی اثر منفی Lin-4 RNA و Lin-14 m-RNA است. به علاوه اتصال ذکر شده تنها موجب کاهش میزان پروتین LIN-14 می شود و بر مقدار Lin-14 MRNA هیچ تاثیری ندارد. به مدت هفت سال، از 1993 تا 2000، Lin-4 تنها مولکول RNA شناخته شده ای بود که با اتصال به مولکول RNA دیگر، بیان پروتین آن را مهار می کرد. ولی در 2003، پژوهش رینهارت و همکاران منجر به کشف RNA جدید موسوم به LET-7 در نماتود الگانس شد که نقش مشابه با LIN-4 داشت.

بخشی از مقاله انگلیسی:

INTRODUCTION

Recent advances in transcriptome analysis and high throughput technologies highlighted an impressive complexity in the RNA world. The most studied RNA regions are protein-coding genes, mRNAs, accounting for around 1.5% of the human genome[1]. The importance of coding mRNAs is undisputable as they have been for years the building brick of experimental biology, culminating in the systematic deletion of coding genes in several species. Not less important are retrotransposons, specific genetic elements which are known to regulate gene expression[2,3]. Since RNA was identified as the crux of genetic regulation, the idea that it carries fundamental information has been extended to novel classes of RNA. More recently, the nonprotein coding portion of the genome gained attention due to its unexpected role in regulating development and disease[4]. Nowadays, most scientists agree in stating that transcription of the human genome is pervasive, therefore raising questions on the function of many uncharacterized RNAs. The discovery of non-coding RNAs (ncRNAs) has changed the way we look at the human genome and led the scientific world to characterize the different types of ncRNAs transcribed in human cells. Although there is not a clear delineation of ncRNA classes, they are usually classified, according to their nucleotides length, in three main groups: Short ncRNAs, mid-size ncRNAs and long ncRNAs[5]. Among short ncRNAs we can distinguish between microRNAs (miRNA) and piwiinteracting RNAs (piRNAs), respectively 19-25 base pairs (bp) and 26-31 bp long. miRNAs are involved in the regulation of gene expression at the translational and stability level[6-8], while piRNAs are involved in DNA methylation and transposon repression[9-11]. Small nucleolar RNAs (60-300 bp) are part of mid-size RNAs and act as guides for rRNA modifications[12], Promoter Associated RNAs (22-200 bp) belong to the same group but their function is obscure[13]. Last but not least, long non-coding RNAs (lncRNAs) comprise all ncRNAs longer than 200 nucleotides and include the largest portion of the non-coding transcriptome[4]. lncRNAs are involved in several biological and pathological processes, such as genomic imprinting, telomere regulation, X-chromosome inactivation, development, stem cell pluripotency, immune regulation, cancer progression and in metastatic potential[14,15]. In particular, a subset of lncRNAs, the T-UCR, themselves target specific miRNAs. The binding between these lncRNAs and miRNAs prevents target transcription degradation determining an intricate coregulation between lncRNAs and miRNAs[16-18] and strictly linking these two different types of ncRNAs. It should be however stressed out that the definition of ncRNA relies mainly on bioinformatic tools that are likely to be challenged in the next future. In particular, open reading frames (ORF) shorter than 100 nucleotides and/or lacking a strong ATG consensus sequence for translational start are considered noncoding. In view of the emergence of alternative translational start sites[19], we may discover that at least some ncRNAs are indeed “coding” for small peptides. The relevance of the non-coding transcriptome in the comprehension of human diseases is highlighted by the impressive number of ncRNAs that are abnormally expressed in cancer, in neurological and heart diseases or in immune disorders. In this context, short RNAs have attracted the attention of most researchers. Here, we focus on miRNA and on their role in translation regulation and cancer. In particular we zoom in the known mechanisms of miRNA-regulated translation, after a brief elucidation of their discovery and biogenesis. Finally, we account for the aberrant expression of miRNAs in cancer and for their therapeutical potential as new drugs.

miRNA: DISCOVERY AND BIOGENESIS

A brief history miRNAs are endogenous, non-coding single stranded RNAs of approximately 19-25 nucleotides in length, found both in animals and plants and involved in post transcriptional regulation[7,20]. Two decades ago the existence of miRNAs was obscure and the scientific community was focused largely on protein-coding genes. However in 1993 the discovery of the first small ncRNA lin-4, in C. elegans, has totally changed the scientists’ point of view[21]. At the time of the first discoveries, two main questions were raised: (1) what is the role of lin-4; and (2) what is its mechanism of action? Genetic studies showed that lin-4 is one of the most relevant genes involved in the control of temporal development of larval stages[22,23]. Almost simultaneously, Lee and collaborators discovered that null mutations of the lin-14 gene were able to cause an opposite phenotype to null lin-4 mutations, suggesting that lin-4 could regulate lin-14[23,24]. How was this regulation taking place? Several groups unequivocally demonstrated that the introduction of mutations in the putative ORF of the lin-4 gene, did not affect its function, concluding that lin-4 did not encode for a protein. Mature lin-4 was found to be present in two small transcripts with different lengths, 22 and 61 nucleotides[24]. Furthermore, mutations in the 3’UTR of lin-14 mRNA and gene fusion experiments showed that lin-14 was downregulated posttranscriptionally by lin-4, delineating the 3’UTR of lin-14 as necessary for the regulation of LIN-4 protein levels[25,26]. These data led to a unified conclusion: lin-4 transcripts were complementary to the 3’UTR of the lin-14 gene and regulated its expression by annealing to its 3’UTR. With a similar approach, seven years later another miRNA was discovered, let-7, which was able to regulate lin-41 expression by binding to its 3’UTR[27,28]. Further, the sequence of let-7 was found conserved among species, from flies to humans. A new era in transcriptomics was now open for study by the entire scientific world!

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

شش بلوک روشن خاموش از 15 نمونه، هرکدام در حبس کردن تنفس و fMRI وظیفه اجباری استفاده شدند: 5 نمونه روش ( به ترتیب مربوط به استنشاق و حبس کردن نفس و یا کار اجباری) و 10 نمونه خاموش (به ترتیب مربوط به تنفس طبیعی یا در حال استراحت/ عمل غیر دستوری). حین fMRI، بیماران پس از شنیدن دستورالعمل‌ها یک عمل حرکتی و/ یا سه عمل گفتاری را انجام دادند. برای مشاهده تمام وظایف انجام شده به جدول 1 مراجعه نمایید. وظایف حرکتی شامل ضربه زدن انگشت در هر دو سمت، ضربه زدن دست و پا، و چرخاندن زبان. در عمل ضربه زنی انگشت از بیمار درخواست شد که با انگشت شست پشت سرهم چهار انگشت دیگر را لمس کند و مجدداً این کار را شروع کند. این امر با سرعت تقریباً دو انگشت در ثانیه انجام شد و قبل از جلسه fMRI تمرین شد. در عمل چرخاندن زبان، از بیماران خواسته شد که حرکت جانبی کوچک زبان را بدون گشودن دهان انجام دهند. در عمل «ضربه زنی پا و دست»، کار ضربه زدن انگشت با ضربه زنی پا ترکیب شد. وظیفه گفتاری عبارت بودند از «حروف»، «افعال»، «شنیداری‌ها» و «طبقات». در وظیفه «حروف»، از بیماران خواسته شد تا واژگان را با یک حرف معین بطور پانتومیم تولید کند. در عمل «افعال»، به بیماران با اسمی داده شد و درخواست کردیم تا کلمات عملیاتی مرتبط با آن تولید کنند. در وظیفه «شنوایی» از بیماران خواسته شد که به انواع متفاوتی از ظایف نامگذاری پاسخ دهند (به عنوان مثال شما با چه چیزی موهایتان را اصلاح می‌کنید؟) و باید بصورت پانتومیم به سوالات پاسخ دهند و از ادای شفاهی آن اجتناب کنند. در عمل « دسته‌بندی»، به بیماران یک طبقه‌بندی مافوق ارائه شد و خواستیم که واژگان وابسته را مطابق با این دسته تولید کنند. برای حبس کردن نفس، به یماران دستور داده شد که یک نفس عمیق بکشند (که حدود 2 ثانیه طول کشید) و سپس قبل از تنفس مجدد معمولی به مدت 18 ثانیه آن را نگه دارند. حبس کردن نفس و fMRI وظیفه‌ای با مجموع 90 نمونه در مجموع (6 بلوک خاموش/روشن از 15 نمونه) طی زمان اسکن 6 دقیقه‌ای برای هر بیمار بدست آمد.
شدت حرکت سر در حبس کردن نفس و اسکن‌های وظیفه با استفاده از شش سری زمانی پارامتر چرخش و ترجمه‌ای اندازه‌گیری شد که از عمل ثبت همزمان سه در AFNI بدست آمد. این پارامترهای حرکتی اسکن‌های حبس کردن نفس و وظیفه‌ دستوری به یک عدد واحد به صورت زیر تبدیل شدند: میانگین مجموع مربع سه پارامتر ترجمه‌ای به میانگین مجموع مربعات پارامترهای چرخشی برای اسکن حبس کردن نفس اضافه شد و سپس این مجموع به میانگین مجموع مربع پارامترهای اسکن وظیفه دستوری معادل افزوده شد. این محاسبه برای تمام 21 اسکن انجام شد و نتایج به ترتیب رتبه (رتبه کوچک معادل حرکت نسبتاً قوی) مرتب شدند و در جدول 1 ارائه شده‌اند.

تحلیل داده‌های fMRI
تمام تجزیه و تحلیل داده‌های fMRI و تصویربرداری اکو پلانار (EPI) حبس کردن تنفس با AFNI [19] و MATLAB ورژن b 2007 (Mathworks) انجام شد.
پیش پردازش به شرح زیر انجام پذیرفت: تصحیح حرکت، ایجاد آستانه مغزی در مقابل پس زمینه، پاک کردن روند خطی واکسل ویز از سری‌های زمانی و صاف کردن فضایی واقع در صفحه با هسته گاوسین از کل عرض در نیمه حداکثر = 3 واکسل.
پس از آن نقشه‌های پارامتری به صورت زیر تولید شدند: اول، نقشه‌های راکتیویته عروقی از طریق همبستگی سری‌های زمان پاسخ حبس کردن نفس x_t با واکسل ویز شاخص عمل دستوری یا مطلوب، تابع I_t تولید شدند، که به عنوان I_t=1 برای نمونه‌های حبس کردن تنفس یا کار دستوری و I_t=0 برای نمونه‌های نفس کشیدن عادی یا در حالت استراحت تعریف شده است. دوماً، تصاویر وظیفه دستوری پارامتری با استفاده از سه روش متفاوت ایجاد شدند: 1. تحلیل استاندارد براساس همبستگی سیگنال BOLD با تابع ایده‌آل،2. تجزیه و تحلیل استاندارد تصحیح شده بر اساس انسجام بین سیگنال BOLD و تابع ایده‌آل، و 3. تجزیه و تحلیل مبتنی بر انسجام که ارزشیابی راکتیویته عروقی را از داده‌های حبس کردن نفس شامل می‌شود.

1. تجزیه و تحلیل استاندارد بر اساس ضرایب همبستگی
در این روش استاندارد، تابع شاخص ایده‌آل یا عمل دستوری I_t که دارای اعداد 1 و 0 است برای بیان زمان‌بندی پارادایم‌های حرکتی و گفتاری استفاده شدند. این روش نیز به عنوان یک تقریب دقیق از تابع پاسخ همودینامیکی ht نیز استفاده شد. تصاویر فعالسازی عمل دستوری با همبستگی سیگنال در هر وکسل یعنی yt با تابع یکنواخت ایده‌آل تعریف شدند و ضریب همبستگی خطی پیرسون R (yt، It) بدست آمد. پاسخ وظیفه دستوری مثبت خیلی مهم مثبت برای R (yt، It)> 0.55 بیان شد. این میزان با میانگین p-value p = 1 × 10^(-5) متناظر است، به منظور مقایسه با انسجام به عنوان یک آستانه خاص در شبیه سازی‌های عددی تنظیم می‌شود (ادامه را مشاهده نمایید). با این حال، احتمال دنباله یکطرفه برای همبستگی خطی پیرسون R (yt، It) = 0.55 برابراست با p = 1.3 × 10^(-8) است. به عبارت دیگر، ارزش p-value دوم به عنوان آماره آزمون برای تعیین اهمیت یک وکسل بکار رفته است. این یک آستانه کاملاً احتیاطی است حتی اگر مشکل آزمون چندگانه در نظر گرفته شود. علاوه بر این، یک آستانه خوشه‌ای ساده استفاده شد؛ فقط خوشه‌های دارای با حداقل دو واکسل مجاور فعالسازی در نقشه‌های نهایی ضرایب همبستگی باقی ماندند.

2. تحلیل استاندارد اصلاح شده براساس انسجام
انسجام طیفی بین دو سیگنال کوچکتر یا مساوی است با 1 و برای وابستگی خطی برابر 1 است. حداکثر میزان همگرایی بین I_t و yt C (yt، It) در یک فاصله (0.006 هرتز، 028 هرتز)، در مرکز فرکانس وظیفه دستوری بلوک 0.017 هرتز به عنوان آماره آزمون استفاده شد. آستانه معنادار متناظر با میانگین p-value p = 1 × 10^(-5) به وسیله شبیه‌سازی مونت کارلو تعیین شد و در C (yt، It) = 0.79 مشاهده شد. فقط خوشه‌های دارای حداقل دو وکسل مجاور فعالسازی در تصاویر انسجام نهایی حفظ شدند.

3. تحلیلی انسجامی که ارزشیابی راکتیویته عروقی را از داده‌های حبس کردن تنفس بدست می‌آورد
فرض رایج و معمولی در بنیادی‌ترین مدلسازی خطی پایه پاسخ‌های BOLD مدل زیر است
y_t= 〖ah〗_t+ ε_t
که در فرمول ht پاسخ همودینامیک است، a یک ضریب برآورد شده از yt است و ε_t نویزی است که توسط مدل ضبط نشده است. معمولاً پاسخ همودینامیکی به طور مستقل از موضع یا یکنواختی در تمام مغز در نظر گرفته می‌شود. با در نظر گرفتن احتمال وابستگی ht به موضع واقع در مغز، که برای ارزیابی تأثیر ذخایر عروقی تغییر یافته با حضور تومورها ضروری است در اینجا فرض کردیم که ht بسته به موضع مغز تغییر می‌کند و می‌توان با اندازه‌گیری راکتیویته عروقی xt مدلسازی شود که از اسکن‌های حبس کردن تنفس با زمان یکسان به عنوان عمل دستوری در یک آزمایش اضافی fMRI در همان بیمار بدست آمد. این فرضیه با مشاهده تأیید شده است که پاسخ عمل دستوری yt و پاسخ حبس کردن تنفس xt غالباً به طور همزمان با I_t در وکسل‌هایی همبستگی یا مخالف بودند که فعالسازی عمل دستوری مهمی مشاهده شد، (به بخش یافته‌ها مراجعه نمایید). براساس این وابستگی ناشناخته میان پاسخ عمل دستوری و پاسخ حبس کردن نفس (راکتیویته عروقی) ما مدل خطی را فرض کردیم، مدل خطی را فرض کردیم.
h_t= L_0 [X_t] که Xt یک الگوی موضعی راکتیویته عروقی است که از سیگنال حبس کردن نفس X_t ناشی می‌شود و L0 یک تابع خطی است. برای مثال این رابطه تأخیرهای احتمالی میان xt و yt را در نظر می‌گیرد. اکنون مدل پاسخ عمل دستوری را می‌توان بصورت زیر نوشت
y_t=L[X_t ]+ ε_t
مجدداً دارای وابستگی خطی کلی ناشناخته L است. بنابراین درجه وابستگی را می‌توان با انسجام میان Xt و yt [20] برآورد کرد و با روش دوم برابر است. الگوی پاسخ عروقی ناحیه‌ای Xt با بدست آوردن میانگین سیگنال حبس‌کردن نفس Xt طی شش دفعه تکرار در هر آزمایش برای هر واکسل بطور جداگانه محاسبه شد. سپس برای بدست آوردن یک سری زمانی الگو Xt با طول مشابه مانند مشاهدات BOLD (yt) در طی آزمایش عمل دستوری، سیگنال بدست آمده از طول متناظر با یک تکرار حبس کردن نفس شش دفعه بهم متصل می‌شوند. لازم به ذکر است که طرح‌های حبس کردن نفس و بلوک عمل دستوری باید از لحاظ طول مطابقت داشته باشند؛ در اینجا از دو پارادایم 20 ثانیه «روشن» (مربوط به استنشاق / حبس کردن نفس و عمل دستوری حرکتی به ترتیب) و 40 ثانیه «خاموش» (مربوط به تنفس عادی و حالت استراحت) تشکیل شد. مشابه تجزیه و تحلیل استاندارد مبتنی بر انسجام، در حال حاضر برای تولید نقشه‌های فعالسازی حداکثر میزان انسجام طیفی C(Yt، Xt) در محدوده فرکانس یکسان فوق استفاده شد. همان آستانه‌های آماری برای انسجام بکار رفتند که در مرحله دوم تعیین شد. فقط خوشه‌های دارای حداقل دو وکسل مجاور فعالسازی در نقشه‌های نهایی انسجام حفظ شدند. نمای تصویری این روش را در شکل 1 مشاهده کنید.

«A» روش استاندارد تجزیه و تحلیل یک مجموعه داده گفتاری fMRI را نشان می‌دهد که داده‌های BOLD fMRI با تابع استاندارد پاسخ همودینامیک (HRF) ایده‌آل مقایسه می‌شود. داده‌های fMRI در منطقه بروکا (سبز) و منطقه ورنیکه (قرمز) مطابق با استاندارد HRF (سیاه) است اما داده‌های fMRI در لوب پس‌سری (به عملکرد گفتاری مرتبط نیست) با استاندارد HFR مطابقت ندارد. این روش سبب «فعالسازی» در منطقه بروکا و ورنیکه شده اما لوب پس‌سری را تحریک نمی‌کند. در «B»، ناحیه تیره‌رنگ توموری را با راکتیویته غیر نرمال عصبی عروقی (جداشدگی عصبی عروقی) نشان می‌دهد که منجر به خاموش(قطع) شدن BOLD HRF می‌شود. در نتیجه HRF در منطقه بروکا دیگر با HRF ایده‌آل مطابقت ندارد و منطقه بروکا دیگر «فعال» نیست. «C» HRF را در هر منطقه حین حبس‌کردن نفس نشان می‌دهد. در منطقه ورنیکه و لوب پس‌سری، HRF حبس‌ کردن نفس نرمال می‌ماند اما در منطقه بروکا، HRF حبس‌ کردن نفس خاموش (قطع) است. در روش افزایش انسجام که در این مقاله بیان شد، به جای مقایسه HRF به دست آمده طی معاینه fMRI به HRF نرمال ما آن را با HRF حبس‌ کردن نفس مقایسه کردیم و این HRF یک مقیاس اندازه‌گیری مستقل از HRF هست. در این شکل مناطق بروکا و ورنیکه با حالت «فعالسازی» نشان داده می‌شوند.

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

تست های کشت سلولی
برای ارزیابی جذب سلولی کورکومین، سلول های سرطانی HeLa از موسسه پاسچر تهران، ایران خریداری شد. سلولها در محیط موسوم به Roswell Park Memorial ( شهری در نیو مکزیکو) با 10٪ سرم جنین گاوی و 1٪ پنی سیلین / استرپتومایسین در 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور CO2 کشت داده شدند. سلول ها با غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر آزاد کورکومین یا بارگیری و ترکیب شدند. پس از 24 ساعت، سلولهای مورد آزمایش با PBS شسته شدند و سپس تحت میکروسکوپ فلورسانس معکوس بررسی شدند. (ابزار نیکون، ملویل، نیویورک، ایالات متحده آمریکا). به منظور ارزيابي اثرات سيتوتوكسيك نيتروژن كركومين، فيبروبلاست هاي فوربك پوست انسان و سلول هاي HeLa با تراكم 103 × 7 ميكروليتر در صفحات 96 كيلويي بذر كشت داده شدند و با غلظت هاي متفاوت كركومين آزاد و كپسول شده به مدت 48 ساعت انكوبه شدند. سپس (MTT 5 میلی گرم بر میلی لیتر) به هر چاه اضافه شد و سلول ها در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 4 ساعت انکوباتور شدند. برای حل شدن رسوب فرانسان آبی، دی متیل سولفوکسید اضافه شد و جذب در 570 نانومتر توسط یک ارزیابی کننده ELISA (BioTek، Winooski، VT، USA) تعیین شد. 

رنگ آمیزی هسته ای
همانند آزمایش MTT، سلول از خط سلولی HeLa کشت شدند و به مدت 48 ساعت با NP خالص، کورکومین یا NPC های کورکومین انکوباتور شدند. سپس، سلول ها با PBS شسته شدند و با پروما فرمالدئید 4٪ ثابت به مدت 20 دقیقه ثابت می شدند. پس از شستشو با PBS، برای افزایش نفوذ پذیری، 0.2٪ Triton X-100 به مدت 20 دقیقه اضافه شد؛ در مرحله نهایی، رنگ آمیزی هسته ای به مدت 25 دقیقه با استفاده از DAPI (1 میکروگرم در میلی لیتر سانتا کروز بیوتکنولوژی، سانتا کروز، CA، USA) انجام شد و سلول ها تحت یک میکروسکوپ فلورسنت (نیکون) مشاهده شدند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی کمی (qRT-PCR)
سلول های HeLa به مدت 48 ساعت با NP های خالی، کورکومین و CF-ALG-STPP NPC (50 میکروگرم بر میلی لیتر) کورکومین انکوباتور شدند. سپس آنها با PBS شسته شدند و RNA با استفاده از کل کیت استخراج RNAیکتا تاجیز، تهران، ایران) بر اساس پروتکل تولید کننده استخراج شد. سنتز cDNA با استفاده از کیت رونویسی شده معکوس تجاری (یکتا تاجیز) انجام شد. در مجموع 20 میکرولیتر مخلوط واکنش حاوی 4/0 میکروگرم پرایمر جلو، 0.4 میکروگرم مبدل برگشتی، 2 میلی لیتر cDNA، 10 میکرو لیتر SYBR سبز PCR ترکیبی اصلی(یکتا تاجیز)، 0.4 میکرولیتر کربوکسی-ادرادامین (یکتا تاجیز) و 6.8 میلی لیتر RNase آب آزاد GAPDH به عنوان یک کنترل داخلی مورد استفاده قرار گرفت. سطح ویژگی ژن با روش Ct تجزیه و تحلیل شد. جدول S1 توالی پرایمر و دمای آنیلینگ را نشان می دهد.

تحلیل آماری
داده های آزمون MTT با استفاده از آزمون آماری t مستقل تجزیه و تحلیل شد. نتایج qRT-PCR با استفاده از تجزیه واریانس یک طرفه و سپس پس آزمون توکی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتايج به صورت ميانگين ± خطاي استاندارد ميانگين و p-value 0.05 به صورت آماري معني دار در نظر گرفته شدند.

نتایج
خواص نانوذرات CS -ALG -STPP NPC حاوی کورکومین
نتایج FE-SEM نشان داد که NP-CFC-ALG-STPP دارای کورکومین کروی و اندازه متوسط ~ 50 نانومتر است که با یکدیگر جمع و متراکم می شوند (شکل 1A. ). شکل 1B یک تصویر AFM و نمای سه بعدی آن را نمایش می دهد. مطابق با داده های FE-SEM، اندازه گیری نتایج AFM نیز نشان می دهد که ذرات دارای توزیع اندازه یکنواخت هستند و اندازه های متوسط نانوذرات کورکومین بارگذاری شده 50 نانومتر است (شکل 1C.)

تجزیه و تحلیل طیف سنجی FT-IR
شکل 2 طیف های FT-IR از کورکومین، CS-ALG-STPP و NC-ALG-STPP ترکیب شده کورکومین را نشان می دهد. در طیف نانوذرات CS-ALG-STPP، گروه وسیعی در 3،432 cm-1 به گروه هیدروکسیل و آمین مربوط می شود.

رئوس یا پیکهای نزدیک به 1630 و 1413 سانتیمتر مربع به ارتعاشات متقارن و نامتقارن کششی گروه های COO اختصاص یافته است. علاوه بر این، باند حدود 1،026 cm-1 متعلق به باندهای آمید است. اوج 1،087 cm-1 به علت وجود -CH-OH در الکل سیلیکونی و کشش C-O است. برای کورکومین، پیک در 3،478 سانتیمتر 1 مربوط به گروه های آمین است. پیک جذب در 1510 سانتیمتر مشاهده می شود که مربوط به ارتعاشات C = O و C = C کورکومین است.
علاوه بر این، پیک جذب برای باندهای دوگانه C = C در 1 627 cm-1 در این طیف به دلیل همپوشانی با اوج CS-ALG-STPP واضح نیست. شدت اوج نسبی نانوذراتCFC-ALG-STPP کورکومین کمی ضعیف است، که ممکن است به دلیل وابستگی کورکومین به گروههای کاربردی ماتریس CS-ALG باشد.

راندمان جذب
برای ارزیابی کارایی انکپسولاسيون، تجزیه HPLC بر روی محلول ریخته شده، محلول پس از شستشو با اتانول و مخلوط نانوذراتCS-ALG-STPP کرکومین در آب انجام شد. با محاسبه منطقه زیر پیک، بازده نهایی برای آماده سازی NP حدود 70٪ بود (شکل 3).

انتشار کورکومین در محیط آزمایشگاهی از CS -ALG -STPP NP
مشخصات آزمایشی دارو در یک زمان معین مورد بررسی قرار گرفت و درصد کورکومین آزاد شده از NP-CS-ALG-STPP با استفاده از منحنی استاندارد اندازه گیری شد. شکل 4 آزمایشی آزمایشی داروی NPc کرکومین را نشان می دهد. داده های ما نشان داد که 24٪ و 29٪ از کورکومین پس از 1 و 2 ساعت از NP ها ، به ترتیب آزاد می شوند. سپس، رهاسازی کنترل شده شديد تا 24 ساعت مشاهده شد و 53٪ از کورکومين بارور شده فيزيکي در اين دوره آزاد شد (شکل 4).

جذب کورکومین و نانوذرات CS -ALG -STPP
فرایند ایزوترم برای ارزیابی ظرفیت بارگیری کورکومین بر روی NP-CS-ALG-STPP انجام شد. شکل 5، ایزوترم جذب برای کورکومین و NP-CS-ALG-STPP را نشان می دهد. نتایج تجربی مناسب با معادلات ایزوترم لانگمویار، فروندلیچ، تمکین، الوویچ و لانگمویر فروندلیچ بودند. جدول 1 داده های ایزوترم جذب برای کورکومین را در NP-CS-ALG-STPP و پارامترهای تعادلی نشان می دهد. تجزیه و تحلیل رگرسیون نشان داد که در بین ایزوترم های ذکر شده، مدل ایزوترم لانگموری-فروندلیچ بیشترین خطی بودن را نشان می دهد (R2 = 992).

آزمایشات درون آزمایشگاهی
بر اساس فعالیت فلورسانس ذاتی کورکومین، جذب آن در سلول های HeLa، 48 ساعت پس از انکوباسیون NPC-ALG-STPP NPC کورکومین مورد بررسی قرار گرفت. تصاویر میکروسکوپی فلورسنس نشان داد که سلول های کنترل و آنهایی که با NP-CS-ALG-STPP انکوباتور به عنوان گروه آزمایشی خالی نانوذرات هیچ فعالیت فلورسانس نشان نمی دهد. در مقایسه با گروه های آزمایشی کنترل و خالی ناقل NP ، سلول های HeLa که با آزاد کورکومین یا NPC کروکومین (50 میکروگرم بر میلی لیتر) تحت درمان با فلورسانس سبز قرار گرفته اند (شکل 6A). در مرحله بعد، اثر سیتوتوکسی NPs کرکومین بارگذاری شده با استفاده از آزمون MTT ارزیابی شد. فیبروبلاست های پیش پوست انسان و سلول های HeLa به مدت 48 ساعت با دوزهای مختلف کربوکامین آزاد یا کورکومین بارگذاری نشده CS-ALG-STPP NP (6.25، 12.5، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلی لیتر) انکوباتور شدند. برای ارزیابی سمیت نارسایی های کورکومین بر روی سلول های طبیعی، فیبروبلاست های فورنچه پوست انسان کشت شدند و با غلظت های مختلف کورکومین نانوذرات ترکیبی با کورکومین به مدت 48 ساعت انکوباتور شدند. نتایج حاصل از MTT نشان داد که اثر سیتوتوکسیک قابل توجه در درمان سلول های کروموزوم طبیعی تحت درمان با نانوذرات کورکومین یا نانوذرات ترکیبی با کورکومین (شکل 6B) مشخص نشد. علاوه بر این، اثر سیتوتوکسی NP در بیماران مبتلا به سرطان HeLa مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آزمون زنده ماندن سلول نشان می دهد که NPs کرکومین بارگذاری شده، به ویژه دوز بالای آن ، اثر بازدارنده وابسته به دوز ، به تکثیر سلولی نسبت به گروه کوروکوم آزاد داشت (شکل 6B).

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

حساسیت تست‌ چندگانه‌ی مخصوص برای الل
برای تعیین پایین‌ترین دقت محدوده‌ی تشخیص در تست‌ چندگانه‌ی مخصوص برای الل، DNA جهش‌یافته‌ی KRAS با DNA طبیعی مخلوط شد. میزان DNA جهش‌یافته به مرور کم‌تر و کم‌تر شد تا به کسرهای ۵٪، ۲.۵٪، ۱.۲۵٪، ۰.۶۲٪، ۰.۳۲٪ و ۰.۱۵٪ برسد. واکنش‌ها در قالب سه‌تایی و به همراه یک کنترل منفی انجام شدند.

نتایج
ژنوتایپینگ چندگانه‌ی مخصوص برای الل برای ژن KRAS
ما یک تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل طراحی کردیم که هدف آن غربالگری هفت جهش شایع برای KRAS در کدون‌های ۱۲ و ۱۳ در سرطان کارسینومای روده‌ی بزرگ است و در این راستا از تست PCR کمّی مخصوص برای الل استفاده کردیم (شکل ۱). مرحله‌ی اول شامل یک امپلیکون مرجع بدون جهش بود (واکنش کنترل) که همزمان با تست‌های چندگانه‌ی مخصوص برای الل انجام شد. پس از آن، یک تست تأییدی انجام دادیم که نتایجی تکرارپذیر و بدون اختلاط پرایمرهای مخصوص برای الل‌ها به دست می‌داد. شکل ۲ واکنش‌های تکثیری برای تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل و DNA هر یک از هفت جهش شایع در KRAS را نشان می‌دهد. مقادیر ΔCq در جدول ۱ نشان‌ داده‌ شده‌اند. همچنین، پرایمرهای مخصوص برای الل تنها الگوهای دارای توالی خاص را تکثیر کردند، چرا که PCR کمّی با استفاده از پرایمر مخصوص برای G12S، DNA مربوط به G12V را تکثیر نکرد (شکل ۳).

بررسی جهش ژنتیکی در KRAS با استفاده از نمونه‌های کارسینومای روده‌ی بزرگ
تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل که بر روی ۳۲ نمونه‌ی FFPE سرطان روده‌ی بزرگ انجام شد، در ۲۱ نمونه جهش شناسایی کرد. نمودارهای تکثیر در شکل ۴ نشان داده شده‌اند. واکنش‌ها در قالب سه‌گانه انجام شدند و انحراف‌های معیار منفی و مثبت برای مقادیر ΔCt در جدول ۲ نشان داده‌ شده‌اند. مقایسه‌ی تست‌های چندگانه‌ی مخصوص برای الل و توالی‌یابی سنگر در جدول ۲ ارائه شده است. در این مطالعه به وسیله‌ی PCR کمّی، ما به این نتیجه رسیدیم که ۲۲ از ۳۰ مورد که برای ژن KRAS بررسی شدند، محصولات قابل تکثیر PCR به دست دادند. ۶ مورد با استفاده از روش سنگر هیچ محصول قابل تکثیری به دست نداد، اما با استفاده از تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل،در KRAS جهش نشان داد. این ناهماهنگی بین تست چندگانه و روش سنگر، احتمالاً به دلیل بالا بودن کسر سلول‌های غیرتوموری و حساسیت بالاتر تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل است. در ۸ نمونه، هیچ محصول قابل تکثیری در پی روش سنگر و یا تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل به دست نیامد. ۷ نمونه از این نمونه‌ها، از درمان‌گاه‌های عمومی محلی گرفته شده و احتمالاً به دلیل پردازش نامناسب، متحمل تخریب و واسرشتی DNA شده بودند [۱۷]. این باور به این دلیل است که هیچ تکثیری در مورد این نمونه‌ها دیده نشد. در هر ۸ نمونه، نمونه‌های منفی سه بار با هر دو روش توالی‌یابی سنگر و تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل آزمایش شدند. نمونه‌های دیگر به دلیل عدم توانایی تکثیر امپلیکون جهش‌نیافته، تخریب‌شده انگاشته شدند.

حساسیت تست چندگانه‌ی PCR کمّی برای KRAS
برای اندازه‌گیری حساسیت و اختصاصی بودن تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل، DNAهای استاندارد مرجع که دارای ‌KRAS جهش‌یافته بودند رقیق شدند و با DNA مرجع مخلوط شدند. غلظت DNA جهش‌یافته به مرور کم‌تر و کم‌تر شد تا نسبت DNA جهش یافته به DNA سالم کم‌تر شود. ما می‌توانیم در تست چندگانه‌ تا ۰.۱۵٪(برابر با ۳۵ پیکوگرم) از ‌DNA جهش‌یافته را تشخیص دهیم. مثال‌های نماینده‌ی تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل با استفاده از جهش G12S در DNA ژن KRAS در شکل ۱ بخش تکمیلی مقاله نشان داده شده‌اند. برای سنجش حساسیت تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل، جهش‌های KRAS در مخلوط DNA شامل DNA جهش‌یافته و طبیعی با کسرهای گوناگون (۵٪، ۲.۵٪، ۱.۲۵٪، ۰.۶۲٪، ۰.۳۲٪ و ۰.۱۵٪) مقدارسنجی شدند. نتایج به گونه‌ای تکرارپذیر، خبر از وجود مقادیر مقایسه‌پذیر الل‌های جهش‌یافته‌ی KRAS در همه‌ی دفعات آزمایش دادند. میانگین انحراف معیار مثبت و منفی برای ΔCq که در جدول ۳ نشان داده شده‌اند به وضوح ردیابی جهش‌های شایع KRAS را ممکن ساختند. با این حال، در غلظت‌های پایین‌تری DNA جهش‌یافته، تست چندگانه‌ی ما بیشتر G12S، G13D و G12C را ردیابی کرد.

بحث
با توجه به این که جهش‌های KRAS با مقاومت به روش‌های علیه EGFR (به وسیله‌ی کتاکسیمب و پانیتومامب) هم‌راستایی نشان می‌دهد، نیاز به تست‌های سریع، ارزان‌قیمت و پُرداده حس می‌شود که جهش‌های KRAS را در نمونه‌های بالینی تشخیص دهند. روش‌های توالی‌یابی نسل بعد (NGS) به شدت توصیه می‌شوند، اما استفاده از آن‌ها فراتر از توانایی مالی و تخصصی آزمایشگاه‌های بالینی معمولی است. با این که توالی‌یابی به روش سنگر استاندارد طلایی برای شناسایی جهش‌های DNA محسوب می‌شود، حساسیت پایین آن نیاز به درصدهای بالاتری از سلول‌های توموری (برای مثال، ۱۰ تا ۳۰٪) به دلیل اتصالات ضربدری DNA و یا تخریب DNA به وسیله‌ی فرمالین و یا میزان کم توالی هدف، ایجاد می‌کند [۲۷، ۲۸].
در جدول ۲، برخی نمونه‌های FFPE هم در تست چندگانه‌ی ما و هم در روش توالی‌یابی سنگر نتیجه‌ای به دست ندادند. بافت‌هایی که قادر به تکثیر DNA جهش‌نیافته‌ی کنترل نبودند، از درمان‌گاه‌های محلی گرفته شدند که امکانات و تخصصی محدود در زمینه‌ی پاتولوژی دارند. دیگران نشان داده‌اند که DNA استخراج‌شده از باقت‌های FFPE احتمالاً کیفیت پایینی دارد که می‌تواند منجر به اینجاد نتایج مثبت و منفی کاذب به دلیل عدم تثبیت و یا تثبیت بیش‌از‌حد بافت شود [۲۹]. این می‌تواند منجر به ایجاد نتایج منفی کاذب شود که پیامدهای ناخواسته‌ای برای درمان بیمار با استفاده از مهارکننده‌های گیرنده‌های تایروزین کینازی دارد [۱۷]. برای حذف نتایج منفی کاذب، این گزارش از PCR کمّی حساس چندگانه و مخصوص برای الل جهت تشخیص جهش‌ها در کدون‌های ۱۲ و ۱۳ ژن KRAS همزمان با تشخیص DNAهای مرجع جهش‌نیافته در امپلکون‌های کنترل استفاده کرد [۲۲].
معمولاً، نتایج مثبت کاذب به واکنش‌های ضربدری (برای مثال، آلوده شدن نمونه‌ها) در مراحل تخلیص و یا پردازش FFPE مربوط هستند. با این حال، این مشکل در PCR مخصوص برای الل که بر اساس عملکرد ضعیف Taq در شرایطی که پرایمرها اتصال مناسبی ندارد تبیین شد، حذف می‌‌شود. با توجه به این که پلیمراز Taq در مراحل پایین‌تری در موارد اتصال ناجور با پرایمر آغاز به فعالیت می‌کند، پرایمرهای KRAS برای توالی‌های جهش‌یافته، گاهی به توالی‌های جهش‌نیافته متصل می‌شوند که این امر نتایج مثبت کاذیت با مقادیر بالای Cq ایجاد می‌کند [۳۰]. بنابراین، در این مطالعات، نتایج PCR مخصوص برای الل، در تست‌های تأیییدی ما، برای مقادیر Cq زیر ۴۴ مثبت در نظر گرفته شده‌اند. اگرچه یک تست‌ مشابه یگانه گرازش شد [۲۲]، این رویکرد نیاز به هفت تست‌ PCR مخصوص برای الل متفاوت داشت و منجر به مصرف DNA الگو و واکنشگرهای Taqman بیشتر پیش از ردیابی جهش می‌شد. بر خلاف این، تست چندگانه‌ی ما به شکل همزمان ه پرایمر جهش‌یافته و کاوشگر را در یک لوله‌ی آزمایش آنالیز می‌کند و مواد مورد نیاز جهت آزمایش را کاش می‌دهد که این امر در موارد استفاده از بافت‌های FFPE که در آن‌ها میزان DNA جهش‌یافته در مقایسه با DNA سالم کم است، اهمیت دارد [۲۲، ۳۱، ۳۲]. با این که اخیراً یک تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل با استفاده از روش استاندارد PCR نقطه‌ی پایانی و لکه‌گذاری ژل اسید نوکلئیک به وسیله‌ی رنگ سایبر سبز یک برای شناسایی جهش‌های KRAS در نمونه‌های بالینی به کار گرفته شد [۱۰]، این روش نیازمند دستکاری‌های پس از PCR است که همواره خطر آلوده شدن نمونه‌های آزمایشگاهی را بالا می‌برد، چرا که شامل یک روش PCR نقطه‌ی پایانی و پس از آن، جداسازی به وسیله‌ی الکتروفورز برای شناخت محصولات ۶۴ یا ۶۸ جفت‌بازی است که با جهش‌های G12S و G12V (به ترتیب) در ژن KRAS هم‌خوانی دارند. اگر چه این محصولات کوتاه ممکن است حقیقی باشند [۱۰]، در برخی نمونه‌ها ممکن است حاصل تکثیر محصولات جانبی PCR نقطه‌ی پایانی با وزن کم باشند، به ویژه که به وجود هیچ کاوشگر اختصاصی KRAS اشاره نشده است [۱۰]. همچنین، آنالیز الکتروفورزی رنگ سایبر سبز یک که استفاده شده است، منجر به محدودیت این روش در مطالعات پُرداده می‌شود. بر خلاف این، روش چندگانه‌ی مخصوص برای الل ما نه تنها بالقوه می‌تواند نسخه‌های کمیاب DNA جهش‌یافته را ردیابی کند، بلکه استفاده از کاوشگرهای فلورسنت منجر به افزایش حساسیت، اختصاصی بودن و تکرارپذیری آزمایش می‌شود.
این تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل می‌تواند اجازه‌ی غربالگری سریع، ارزان‌قیمت و پُرداده‌ی جهش‌های شایع ژن KRAS را در یک مرحله، با استفاده از هفت پرایمر اختصاصی برای الل‌ها (G12D، G12A، G12R، G12C، G12S، G12V و G13D)، پرایمر‌های شایع Reverse و کاوشگر TaqMan بدهد. بر خلاف گزارش‌هایی که از پلازمید DNA ژن KRAS استفاده کرده‌اند [۱۰، ۲۱] تا حساسیت تست را بسنجند، این تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل با استفاده از DNA انسانی مرجع که از نمونه‌های بالینی و یا سل‌لاین‌های سرطانی گرفته شده‌اند استاندارد شد و توانایی تشخیص چندگانه‌ی حداقل ۰.۱۵٪DNA جهش‌یافته (تقریباً ۲۵ پیکوگرم، معادل ۵ کپی از DNA جهش‌یافته‌ی KRAS) را نشان داد. ردیابی اولیه‌ی جهش‌ها در این روش چندگانه، شناسایی اختصاصی هر جهش را با استفاده از تست‌های جداگانه‌ی مخصوص برای هر الل به دنبال دارد. کیت Cobas KRAS که به لحاظ تجاری قابل تهیه است حساسیتی کم‌تر از ۵٪ برای تشخیص جهش‌های KRAS در کدون‌های ۱۲/۱۳ و کدون ۶۱ دارد. از طرف دیگر، تست PCR تراسکرین RGQ برای ژن KRAS بر اساس گزارش‌ها حساسیت ۱٪ برای تشخیص جهش‌ها در پلازمیدها و سل‌لاین‌ها از خود نشان می‌دهد و هفت جهش در کدون ۱۲/۱۳ شناسایی می‌کند [۳۳]. دیگران اشاره کرده‌اند که کیت PCR تراسکرین RGQ (کیاژن) یا Cobas KRAS (TaqMelt PCR) گران‌قیمت هستند و هزینه به ازای هر نمونه هم به نوع کیت مورد استفاده و هم به کشوری که کیت در آن فروخته می‌شود بستگی دارد. هزینه‌ به ازای هر نمونه برای تست تراسکرین تا سال ۲۰۱۲ برابر بود با ۱۴۳ دلار آمریکا در ایالات متحده آمریکا و این هزینه کم‌تر نشده است. در استفاده از تست Cobas KRAS، هزینه‌ به ازای هر نمونه برابر است با ۹۵ دلار آمریکا و علاوه بر این، تجهیزاتی به جز آن چه برای PCR زمان واقعی نیاز است نیز باید تهیه شود. هزینه‌ی بالا منجر به سختی استفاده از این کیت در فرایندهای بالینی معمولی با تعداد نمونه‌های زیاد می‌شود [۳۴]. دیگر محدودیت‌های مهم برای استفاده از این کیت‌ها، نیازمندی آن‌ها به غلظت‌های بالای ابتدایی DNA است. کیت Cobas KRAS نیازمند ۱۰۰ نانوگرم DNA و کیت تراسکرین نیازمند بین ۱۰۰ تا ۲۰۰ نانوگرم DNA ورودی است، در حالی که تست چندگانه‌ی ما نیازمند ۲۵ نانوگرم DNA در مجموع بود [۳۴]. همچنین، در کشورهای در حال توسعه، هزینه‌ی واردات این کیت‌های آزمایشی، تهیه‌ و استفاده از آن‌ها را مشکل‌تر می‌کند.

معنا‌داری
جهش‌های نابرابر KRAS ممکن است ارزش‌های پیش‌بینی‌کننده‌ی متفاوتی داشته باشند [۲۸، ۳۰]. با این که تست ما جهش‌هایی در KRAS موجود در اگزون ۲، کدون ۱۲ و ۱۳ با حساسیت کمتر یا برابر ۰.۱۵٪ شناسایی کرد، این تست چندگانه نسبت به شناسایی G12S، G13D و G12C در غلظت‌های پایین DNA جهش‌یافته، تورش داشت. شناسایی جهش G12C در کارسینومای ریه‌ی non-small (NSCL) اهمیت بسیار زیادی دارد، چرا که این جهش در سرطان مذکور بسیار شایع است و هم‌راستایی قابل‌توجهی با پیش‌بینی بیماری و مقاومت به روش‌های درمانی مهار تایروزین کینازی دارد [۳۵]. از طرف دیگر، جهش G13D ممکن است تأثیرات کم‌تر وخیمی پس از درمان با کتاکسیمب در سرطان روده‌ی بزرگ داشته باشد [۳۶، ۳۷]. بر خلاف این، بیمارانی که تومورهای سرطان روده‌ی بزرگ دارای جهش‌های KRAS در موقعیت‌های G12V یا G12A دارند، دارای کم‌ترین بقا بودند [۳۱، ۳۲، ۳۵]. در مجموع، تست ما می‌تواند برای شناسایی جهش‌های KRAS در سرطان روده‌ی بزرگ یا کارسینومای ریه‌ی non-small استفاده شود [۳۷، ۳۸، ۳۹].

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

Hamamci و همکارانش روش “بُرش تومور” را ارائه کرده اند. این روش قطعه بندی نیمه خودکار نیاز دارد که کاربر حداکثر قطر تومور را بر روی تصاویر MRI ورودی رسم کند. پس از این مرحله ی راه اندازی، یک روش قطعه بندی تومور مبتنی بر اتوماتای سلولی (CA) دو بار اجرا می شود، یک بار برای قسمت تومو آماده توسط کاربر و یک بار نیز برای قسمت های پس زمینه تا یک نقشه ی احتمالی از تومور را به دست آورد. این رویکرد مستلزم استفاده از الگوریتم برای هر مدل MRI یعنی T1 ) ،T2 ،Gd-T1 و ( FLAIR به صورت جداگانه است، سپس نتایج ترکیب می شوند تا حجم نهایی تومور به دست آید.
یک روش جدید نیمه خودکار یک رویکرد دسته بندی جدید را به کار گرفته است. در این رویکرد مسئله ی قطعه بندی به یک مسئله ی دسته بندی تبدیل شده و یک تومور مغزی با استفاده از آموزش و دسته بندی تنها در داخل همان مغز قطعه بندی شده است. به طور کلی، روش های دستهب ندی با استفاده از یادگیری ماشین، برای قطعه بندی تومور مغزی، به مقدار زیادی از اسکن های MRI مغزی (با زمینه حقیقت شناخته شده) از موارد مختلف تا آموزش، نیاز دارند. این نتایج نیاز به سر و کار داشتن با اصلاح بایاس شدید و دیگر نویزها را دارند. با این حال در این روش، کاربر پروسه را به وسیله انتخاب زیرمجموعه ای از واکسل ها متعلق به هر نوع بافت از یک مورد واحد، راه اندازی می کند. برای زیرمجموعه از واکسل ها، الگوریتم مقدارهای شدت را تنها به همراه مختصات فضایی آنها به عنوان ویژگی استخراج نموده و یک ماشین بردارپشتیبان (SVM) را آموزش می دهد که برای دسته بندی تمام واکسل های همان تصویر از همان نوع بافت مربوطه مورد استفاده قرار گرفته است.
روش های نیمه خودکار قطعه بندی تومور مغزی نسبت به روش های دستی زمان کمتری نیاز دارند و می توانند نتایج کارآمد ی را به دست آورند، ولی آنها نیز همچنان نسبت به تغییرات بین و درون کاربر/تخمین زننده (ارزیاب) وابسته هستند. بنابرای، نتایج قطعه بندی تومور مغزی فعلی، عمدتا روی روش های تمام خودکار تمرکز می کند.

2.3. روش قطعه بندی تمام خودکار
در روش های قطعه بندی تومور مغزی تمام خودکار، هیچ تعامل با کاربر لازم نیست. عمدتاً هوش مصنوعی و دانش قبلی برای حل مسئله قطعه بندی ترکیب شده اند.

2.3.1. چالش ها
قطعه بندی خودکار گلیوما یک مسئله بسیار چالش برانگیز است. داده مربوط به MRI مغزی تومور داده ی سه بعدی است که شکل ، اندازه و مکان تومورمی تواند تا حد زیادی از بیمار تا بیمار متفاوت باشد. همچنین محدوه های مرزی تومور معمولاً نا مشخص و نا منظم با وجود ناپیوستگی ها هستند، که به طور ویژه در مقابل روش های سنتی مبتنی بر لبه ، چالش بزرگی را ایجاد می کند. علاوه بر این ها ، داده MRI تومور مغزی به دست آمده از اسکن های بالینی یا پایگاه داده های مصنوعی ذاتاً پیچیده هستند. دستگاه های MRI و پروتکل های مورد استفاده برای دستیابی می توانند اسکن به اسکن با تحمیل اثر شدت بایاس ها و متغیرهای دیگربرای هر قطعه متفاوت از تصویر در پایگاه داده، تغییر کند. نیاز به چند روش برای قطعه بندی موثر زیرنواحی تومور، حتی به این پیچیدگی اضافه می کند.

2.3.2. مجموعه داده BRATS
ارزیابی هدفمند نتایج روش های متعدد قطعه بندی تصویر تومور مغزی، با روش جدید کار بسیار دشواری است. با این حال، با توسعه ی معیار BRATS ،معیاری که به طور گسترده ای برای قطعه بندی خودکار تومور مغزی مورد قبول واقع است، در حال حاضر برای قطعه بندی تومور مغزی خودکار، ممکن است تا به طو هدفمند روش های متعدد قطعه بندی گلیوما با استفاده از این مجموعه داده ی رایج امکانپذیر ممکن کند. نسخه ی فعلی (2015) از مجموعه دادگان آموزشی BRATS شامل 274 عدد اسکن MRI چند-وجهی از بیماران با گلیوما (هر دو درجه بالا و پایین) به همراه قطعه بندی هایی است که به صورت دستی توسط متخصص انجام شده اند، برای ارزیابی است. زیرا برای داده های آزمایش، 110 عدد اسکن با سطوح نا مشخص و محدوده های تومور(واقعیت اساسی) نامشخص در دسترس هستند. ارزیابی از داده های آزمایش فقط با ابزار ارزیابی آنلاین امکان پذیر است. نتایج توسط ابزار عمدتا به وسیله ابزار در فرم شناخته شده امتیاز تاس ، حساسیت (نرخ مثبت صحیح) و ویژگی (نرخ منفی صحیح) برای سه ناحیه اصلی تومور ارائه می شود: تومور کامل (تمام اجزای تومور) ، تومور هسته (تمام اجزای تومور به جز تورم) و تومور فعال (فقط سلولهای فعال). ما فقط نمرات تاس را به عنوان مقیاس های عملکرد گزارش می کنیم. برای هر ناحیه تومور ، P1 نشان دهنده منطقه تومور تقسیم شده با روش پیشنهادی و T1 منطقه تومور واقعی در حالت واقعی (توسط متخصص واقعی) را نشان می دهد. سپس ، امتیاز تاس توسط ابزار آنلاین برای هر ناحیه محاسبه می شود:
(P,T) = (|P1ΛT1| )/((|P1| + |T1|)/2)
که Λنشاندهنده ی عملگر منطقی ANDاست و علامت |.|نیز به اندازه ی مجموعه (تعداد واکسل های متعلق به آن) اشاره دارد.

2.3.3. انواع روش های قطعه بندی تومور مغزی خودکار
روش های قطعه بندی خودکار تومور مغزی می توانند بدین صورت دسته بندی شوند: روش های تفکیک کننده و تولید کننده. بررسی های (مرور) جزئی تر این روش‌ها قبلا ارائه شده است.
نتایجی گزارش شده قبلی، نشان می دهند که روشهای مبتنی بر دسته بندی تفکیککننده به طور کلی عملکرد بالایی در میان سایر روش های خودکار دارند. روش های تفکیککننده سعی می کنند رابطه ی بین تصویر ورودی و محدوده هایی را که قبال توسط متخصص به صورت دستی (واقعیت اساسی) مشخص شده اند را یاد بگیرند. آنها به طور عمده بر انتخاب ویژگی ها و استخراج این ویژگی ها تکیه دارند. در بیشتر موارد آنها تکینک های یادگیری نظارت شده را استفاده می کنند که مجموعه داده بزرگی با واقعیت اساسی را نیاز دارد. از سوی دیگر، روش های تولید کننده به تولید مدل‌های احتمالی با استفاده از دانش قبلی مانند وسعت مکانی و فضایی بافت های سالم می پردازند. اطلاعات مکانی بافت های سالم که از قبل مشخص هستند، برای استخراج اجزای ناشناخته تومورمورد استفاده قرار می گیرند. با این حال، تبدیل دانش قبلی به مدل های احتمالی مناسب، یک کار پیچیده است. اگر چه روش نیمه خودکاری که وسط Kuwon و همکارانش ارائه شده است، بهرین مدل تولید کننده را پیشنهاد می دهد.

2.3.4. خط لوله های پردازش در روش خودکار
اکثر روش های تفکیک کننده ارائه شده خط لوله پردازش مشابهی را پیاده سازی می کنند که شامل مراحل پیش پردازش، استخراج ویژگی، دسته بندی و پس پردازش است. مرحله پیش-پردازش معمولا شامل عملیات خذف نویز، حذف تصویر جمجمه و اصلاح بایاس شدت است. پس از مرحله پیش پردازش، روش های پردازش تصویر برای استخراج ویژگی های مورد استفاده قرار می گیرند که هر نوع بافت متمایز را به صورت کارآمدی مشخص می کنند. ویژگی هایی مانند ویژگی های مربوط به عدم تقارن، تبدیل موجک گسسته (dwt)، textones، ویژگی های حرکت براونی با چندین فراکتال، ویژگی های آماری درجه اول، شدت های خام ، بافت های محلی تصویر، گرادیان های شدت و ویژگی های مبتنی بر لبه بری از این نمونه ها هتسند. با استفاده از این ویژگی ها، انواع مختلفی از دسته بندی ها مانند شبکه عصبی (NN)، ماشین های بردار پشتیبان (SVM)، AdaBoost، دسته بند k-نزدیک ترین همسایه (kNN)، نگاشت های ود سازمان دهنده (SOM)، و جنگل های تصادفی (RFs) پیاده سازی می‌شوند تا نتایج مناسب و مفیدی از قطعه بندی تولید شود. در برخی از موارد، نتایج قطعه بندی اصلاح می شود تا عملکرد افزایش یابد. میدان های تصادفی شرطی (CRF) و اجزای متصل (CC) نیز در بین گزینه های انتخابی محبوب قرار دارند. به عنوان بهترین روش رایج تفکیک کننده، Tustison و همکارانش از ویژگی های مربوط به عدن تقارن و ویژگی های آماری درجه اول برای آموزش جنگل های تصادفی (RFهای) به هم پیوسته استفاده کرده اند. و این کار را با تعریف خروجی جنگل تصادفی اول به عنوان جنگل دیگر انجام داده اند. اگرچه این روش های دسته بندی رایج عملکرد بالایی را گزارش کرده اند، ولی مسیر جدیدی در روش های تمام خودکار قطعه بندی تومور مغزی براساس روش های یادگیری عمیق نیز با نتایج بالایی در حال ظهور است.

3. روش های یادگیری عمیق
عملکرد های اخیر روشهای یادگیری عمیق ، به ویژه شبکه های عصبی کانالوشنی (CNN) ، در چالش های متعدد تشخیص شی و قطعه بندی تصاویر بیولوژیکی چالش ها محبوبیت آنها را در بین تحقیقات افزایش داده است. در مقایسه با روش های قطعه بندی معمولی و رایج که ویژگی های را به عنوان ورودی دریافت می کنند که به صورت دستی ایجاد شده اند، شبکه های عصبی کانولوشنی به طور خودکار ویژگی های پیچیده ی مورد نظر را به طور مستقیم از خود داده ها یادگیری می کنند. با توجه به این خاصیت ، تحقیق بر روی قطعه بندی تومورمغزی مبتنی بر اساس شبکه های عصبی کانالوشنی CNN به طور عمده بیشتر بر طراحی معماری شبکه تمرکز دارد تا اینکه بر روی پردازش تصویر برای استخراج ویژگی تمر کز داشته باشد. تکه های شبکه های عصبی کانالوشنی از تصاویر به عنوان ورودی ها استخراج می شوند و از فیلترهای قابل آموزش کانالوشنی و نمونه برداری محلی برای استخراج سلسه مراتبی از ویژگی های پیچیده ای استفاده می کنند که به طور فزاینده ای در حال افزایش هستند. اگرچه در حال حاضر روش های مبتنی بر CNN از نظر تعداد در مقایسه با روش های معمولی و روش های تقسیم بندی تومور مغزی سنتی ، بسیار کم است ولی با توجه به نتایج فوق العاده پیشرفته بدست آمده از روش های قطعه بندی تومور مغزی مبتنی بر CNN، ما در این بخش به بررسی این روش ها می پردازیم. مقایسه یادگیری عمیق و روش های قطعه بندی معمولی گلیوما در جدول 1 ارائه شده است.
Urban و همکاران یک معماری سه‌بعدی CNN را برای انجام قطعه بندی چند وجهی گلیوما MRI پیشنهاد داده اند. تکه های سه بعدی چند وجهی ، اساساً مکعب هایی از واکسل ها ، از روش های مختلف MRI مغز استخراج شده و به عنوان ورودی به CNN استفاده می شوند تا برچسب بافت واکسل مرکز مکعب را پیش بینی کند. ورودی دارای اطلاعات 3 بعدی در مدت شدت فضایی ویک بعد اضافی برای روش های MRI است. بنابراین داده های ورودی 4 بعدی به طور موثر توسط CNN اداره می شود. در حالی که پردازش ابعاد بزرگ می تواند ماهیت سه‌بعدی ساختارهای بیولوژیکی را بهتر نمایان کند ، باعث افزایش بار پردازشی شبکه نیز می شود. در مورد معماری ، دو شبکه مختلف طراحی شده اند. اولین مورد ، یک CNN با چهار لایه است که لایه ورودی شامل 15 فیلتر سه بعدی است که دارای 5 بعد فضایی و با یک بعد 4 ام اضافی هستند که بعد چهارم متناطر با روش MRI است و در نتیجه شکل فیلتر 5 x 5 x 5 x4 است. دو فیلتر لایه پنهان نیز 5 بعد فضایی به علاوه یک بعد دیگر دارند که بعد اضافی با تعداد فیلترهای موجود در لایه قبلی مربوط دارد. تعداد فیلتر ها در هر لایه مخفی برابر با 25 عدد است. عدد آخر ، لایه softmax شامل 6 فیلتر برای هر نوع بافت است که باید دسته بندی شودو بدین ترتیب خروجی به عنوان احتمالات ممکن تفسیر می شود (برای مثال معماری به شکل 3 را ببینید). شبکه دوم به استثنای یک لایه پنهان اضافی با 40 فیلتر اندازه 5 تقریباً یکسان است. اجزای متصل برای محله پس از پردازش نتایج استفاده می شوند. میانگین نتایج گزارش شده از دو شبکه پیشنهادی در مجموعه داده BRATS برابربا مقدار امتیاز تاس 87٪ برای کل منطقه تومور ، 77٪ برای هسته منطقه تومورو 73٪ برای ناحیه تومور فعال است که نتایح بسیار امیدوار کننده است.

مقالات انگلیسی و ترجمه های فارسی رایگان با فرمت PDF آماده دانلود رایگان میباشند

همچنین ترجمه مقاله با فرمت ورد نیز قابل خریداری و دانلود میباشد

مقاله انگلیسی رایگان (PDF)

ترجمه فارسی رایگان (PDF)

خرید ترجمه با فرمت ورد

فهرست مقاله:

مقدمه

اپیدمیولوژی

سندرم های ژنتیکی مرتبط و یا مستعد کننده ی ASD

X شکننده (FMRI)

سندرم رت و جهش های MECP2

توبراسکلروزیس TSC1 یا TSC2

سندرم تیموتی – جهش CACNA1C

سندرم فلان – مک درمید (phelan Mcdermid) – حذف SHANK3

سندرم تومور هامارتوما – موتاسیون PTEN

جهش های CNTNAP2

حذف یا مضاعف شدگی 15q11-13 مادری / پدری

اکسی توسین (ژن OXT)

بیماری های مادری و ASD در فرزندان

ASD در فرزندان مادران دیابتی

بیماری خودایمن مادری

پره آکلامپسی (تشنج بارداری)

منشا التهابی و عفونی ASD

مطالعات اپیدمیولوژیک جمعیت

سرخچه مادرزادی

CMV

آنفولانزا

التهاب مطالعاتی که سیستم ایمنی مادر را ارزیابی کرده اند

نتیجه گیری

در معرض قرارگیری با داروها و مواد شیمیایی در طی بارداری و ASD در فرزندان

در معرض قرارگیری با SSRI ها

در معرض قرار گیری با پاراستامول

در معرض قرار گیری با آگونیست رسپتور آدرنرژیک بتا 2

در معرض قرار گیری با والپوریک اسید

بخشی از ترجمه فارسی مقاله:

مقدمه
ASD توسط DSM 5 به صورت یک بیماری عصبی رفتاری تعریف می شود که با نقایص مزمن در تعاملات اجتماعی و ارتباطی، نقص در ایجاد، درک و حفظ روابط و همچنین علاقه های غیر طبیعی و کلیشه ای و رفتار تکراری نمود پیدا می کند (Kogan et al., 2009; American Psychiatric Association, 2013). علایم در ابتدای دوران کودکی حضور دارند و با عملکرد روزانه تداخل می کنند. ASD، در مردان 4 برابر شایع تر از زنان است، اما در مدل های حیوانی آزمایشگاهی که در آن ها ASD توسط تراتوژن های عصبی القا می شود، تفاوت های جنسی کمی وجود دارد. اختلال ذهنی در بین کودکان مبتلا به ASD معمول است و یک طیفی از تغییرات یادگیری و رفتاری نیز در حیوانات اوتیسمی غالب است. سبب شناسی مختلف است، و به مقدار زیادی ناشناخته است و به نظر می رسد که ناشی از تعاملات محیطی و ژنتیکی باشد (Kogan et al., 2009; Tchaconas and Adesman 2013).
در معرض قرار گیری محیطی به مقدار زیادی به عنوان فاکتورهای خطر بالقوه برای ASD شناسایی شده است و این احتمال که محیط پیش زادی و پری ناتال برنامه ریزی رویان را تحت تاثیر قرار دهد، یک جهت رو به گسترش برای پژوهش ها می باشد. محیط پیش زادی شامل استفاده ی مادر از دارو، عفونت مادری و التهاب و در معرض قرار گیری پیش زادی و پری ناتال با مواد مختلف مانند الکل و آلودگی شدید هوا می باشد. از ارتباط ویژه، بلوغ زودرس و دیابت مادر می باشد.
اپیدمیولوژی
شیوع گزارش شده ی اوتیسم، در طی زمان از 4 تا 5 مورد در هر 10000 نفر در 1966 به حدود 1% در عصر حاضر، به صورت دراماتیک افزایش پیدا کرده است (Kogan et al., 2009; Tchaconas and Adesman, 2013). به نظر می رسد که این افزایش ناشی از افزایش آگاهی عموم، تغییر استانداردهای تشخیصی، سن تشخیص پایین تر، و توسعه ی روش های درمانی باشد. همچنین نشان داده شده است که بسیاری از کودکان و بالغینی که قبلا با عقب ماندگی ذهنی شناسایی شده بودند با معیارهای تشخیصی DSM 4 و DSM 5 ASD نیز مواجه می شوند (Shattick, 2006; Elsabbagh et al., 2012). به هرحال، مقداری از افزایش ممکن است ناشی از علل محیطی جدید مانند آلودگی و تغییر سبک زندگی باشد.
برای مثال، در US، شبکه پایش اوتیسم و اختلالات نموی (شبکه ADDM)، در کودکان 8 ساله در سال 2008، یک افزایش از 150/1 نفر در سال 2000 تا 88/1 در سال 2008 را مشاهده کرد و در سال 2010 نرخ افزایش را به صورت 68/1 کودک پایش کرد (Autism Developmental Disabilities Monitoring Network Surveillance year principal centers for Disease prevention, 2012).
در اسرائیل، قضاوت از روی کودکانی که از امکانات معلولیت دوران کودکی ناشی از ASD موسسه ی بیمه ی اسرائیل استفاده می کردند، بروز انباشته در 8 سالگی در سال 2011، نسبت به سال 1991، 10 برابر افزایش پیدا کرده بود و به 0.49% رسیده بود به طوری که نسبت مرد / زن حدود 5 بود (Raz et al., 2015b).
شیوع جهانی بیشتر اوتیسم حدود 0.62% تخمین زده شده بود (Autism Developmental Disabilities Monitoring Network Surveillance year principal centers for disease prevention 2012; Elsabbagh et al., 2012). به رغم تفاوت گسترده در شیوع در بین مطالعات، محققین، نتیجه گرفتند که هیچ شاهدی از تاثیر معنی دار فاکتورهای اخلاقی یا اجتماعی اقتصادی روی نرخ ASD وجود ندارد.
می توان فرض کرد که در کشورهای توسعه یافته، پیشرفت زیاد در تشخیص و درمان ASD، حداقل در ده سال گذشته، به یک وضعیت نسبتا ثابت رسیده است. به هرحال، هم بروز و هم شیوع ASD رو به افزایش است که دلالت براین دارد که این افزایش تا حدی ناشی از یک افزایش واقعی در نرخ ASD می باشد. برای مثال، در UK، در 1988-92، بروز برابر 10000/0.40 فرد در سال بود و در 2001-2000 آن به 10000/2.98 فرد در سال افزایش پیدا کرده بود (Smeeth et al., 2004) و در US، یک افزایش در همان ایالات در US بین 2000 و 2008 و یک افزایش بیشتر بین 2008 و 2010 گزارش شده بود (fombonne, 2009; Autism Developmental disabilities monitoring network surveillance year principal centers for disease prevention, 2012). یک افزایش بروز نیز در اسرائیل گزارش شده بود (Davidovitch et al., 2013). اگر این صحیح باشد، آن به مقدار زیادی ناشی از دلایل زیست محیطی پیش زادی می باشد چون عوامل ژنتیکی، اخلاقی، اجتماعی اقتصادی، و ژئوگرافی به طور معنی داری در طی آن دوره تغییر نمی کنند. آنالیز متای اخیر روی 7 مطالعه که شامل 1.140.210 کودک بود و ارتباط بین فاصله ی بین بارداری و افزایش ریسک ASD را بررسی کرده بود، یک OR=1.9 را برای بازه ی کمتر از 12 ماه و یک OR=1.37 را برای بازه ی بیشتر از 5 سال به دست آورده بود. مکانیسم های پیشنهادی شامل کمبود فولات، تنش مادری و التهاب مزمن پس از وضع حمل ناشی از بارداری قبلی برای بازه ی کوتاه و ناباروری، بارداری ناخواسته و التهاب بلند مدت بودند (conde – Agudelo et al., 2016). استعداد ژنتیکی توسط داربرو و همکارانش پیشنهاد شده بود همان کسی که کاهش ریسک سرطان را در بین بیماران ASD مشاهده کرده بود. با وجود افزایش شیوع اختلافات نادر کد کننده ی تک نوکلئوتیدی در انکوژن ها، آن ها نئوپلاسم کمتری را توسعه داده بودند. آن ها فرض کرده بودند که اثر حفاظتی ممکن است ناشی از نقص در تکثیر سلولی و افزایش سن باشد (Darbo et al., 2016).
دلایل پیش زادی ASD می تواند به صورت مواد شیمایی زیست محیطی (یعنی، داروهایی مانند والپوریک اسید، تالیدومید، میزوپروستول، الکل، کوکائین، و فلزات سمی که توسط مادر در طی بارداری دریافت می-شود)، در معرض قرار گیری با ذرات جامد آلوده کننده هوا تا قطر 2.5 میکرون (PM2.5)، عفونت های مادر در طی بارداری (یعنی سرخک، CMV)، التهاب مادری و رویانی (Fox et al., 2012)، و بیماری های مادری (یعنی دیابت ملیتوس)، از جمله بیماری خود ایمنی (Brown et al., 2015)، یا بیماری های آلرژیک مانند آسم (Croen et al., 2005) تقسیم بندی شود. به علاوه، عوامل پری ناتال مانند آسفیکسی پری ناتال، IUGR، RDS و سایرین نیز با یک افزایش در شیوع ASD مرتبط هستند (Gardner et al., 2011).
مکانیسم های متعددی برای ASD بر اساس مدل های حیوانی آزمایشگاهی پیشنهاد شده اند. علاوه بر حساسیت ژنتیکی پیچیده، تغییرات ژنتیکی اپی زنتیکی نیز پیشنهاد شده اند (Kogan et al., 2009). سایر مکانیسم ها شامل: اختلال در تنظیم ایمنی می باشد که شامل سطوح غیر طبیعی از سایتوکاین ها و فاکتورهای رشد و آنتی بادی های مختلف رویانی و مادری در مقابل بافت مغز (Rossignol and Frye 2012) است. مکانیسم های پیشنهادی دیگر شامل افزایش تنش اکسیداتیو، اختلال عملکرد میتوکندریایی، ناهنجاری در سروتونین مغز، اتصال غیر طبیعی ماده سفید، کاهش تعداد سلول های پورکینژ در مخچه و نقایص مهاجرت عصبی می باشد (Billeci et al., 2012; Grabrucker, 2012; Rossignol and Frye, 2012).
هدف مطالعه ی اخیر خلاصه کردن داده های توصیف کننده ی سندرم های ژنتیکی همراه با ASD مانند بیماری مادری و رفتاری مرتبط با افزایش شیوع ASD می باشد. به علاوه، ما عوامل آسیب زننده ی پیش از تولد که به نظر می رسد با سبب شناسی و پاتوژنز ASD مرتبط باشد را به طور خلاصه بیان کرده ایم.

بخشی از مقاله انگلیسی:

INTRODUCTION

ASD is defined by the DSM 5 as a neurobehavioral disorder manifested by persistent deficits in social and communication interaction, deficits in developing, understanding and maintaining relationships, as well as abnormal and fixed interests and repetitive behavior (Kogan et al., 2009; American Psychiatric Association, 2013). Symptoms must be present at early childhood and interfere with daily function. ASD is 4 times more prevalent in males than in females, but in experimental animal models where ASD is induced by neuro-teratogens, there are little gender differences. Mental impairment is common among children with ASD, and a variety of learning and behavioral changes are also prominent in autistic animals. The etiology is diverse, largely unknown, and seems to be the result of genetic and environmental interaction (Kogan et al., 2009; Tchaconas and Adesman, 2013). Environmental exposures are increasingly being recognized as potential risk factors for ASD, and the possibility that the prenatal and perinatal environment affect fetal programming is an expanding direction for research. Prenatal environment include maternal use of medication, maternal infection and inflammations, and prenatal or perinatal exposure to various substances such as alcohol and heavy air pollution. Of special relevance are prematurity and maternal diabetes.

Epidemiology

The reported prevalence of autism has increased dramatically over time, from 4 to 5 cases per 10,000 in 1966 to ∼1% today (Kogan et al., 2009; Tchaconas and Adesman, 2013). The increase is thought to result increased public awareness, changing diagnostic standards, earlier age of diagnosis, and development of treatment modes. It was also shown that many of the children and adults who were previously diagnosed as having mental retardation meet the DSM 4 and DSM 5 diagnostic criteria of ASD (Shattuck, 2006; Elsabbagh et al., 2012). Some increase, however, may result from “new” environmental causes such as pollution and changing life style. In the US, for example, the autism and developmental disabilities monitoring network (ADDM network) found in children aged 8 years in 2008 an increase from 1/150 in year 2000 to 1/88 in 2008 and in the 2010 monitoring the rate increased to 1/68 children (Autism Developmental Disabilities Monitoring Network Surveillance Year Principal Centers for Disease Prevention, 2012). In Israel, judging from the number of children who received childhood disability benefits by the Israeli Insurance Institute because of ASD, the cumulative incidence at 8 years of age at 2011 has increased 10-folds from 1991 and reached 0.49% with a ratio of males/females of about 5 (Raz et al., 2015b). The more recent global prevalence of autism was estimated to be 0.62% (Autism Developmental Disabilities Monitoring Network Surveillance Year Principal Centers for Disease Prevention, 2012; Elsabbagh et al., 2012). In spite of a wide variation in prevalence between the studies, the authors conclude that there is no evidence of a significant impact of ethnic or socioeconomic factors on the rate of ASD. It can be presumed that in developed countries the great progress in the diagnosis and treatment of ASD reached a relatively steady state at least in the last 10 years. However, both the incidence and prevalence of ASD continued to rise, implying that some of the increase results from a true increase in ASD rate. For example, in the UK in 1988–92 the incidence was 0.40/10,000 person years and it raised to 2.98/10,000 person years in 2000–2001 (Smeeth et al., 2004) and an in the US an increase was reported in the same states in the US between 2000 and 2008 and a further increase between 2008 and 2010 (Fombonne, 2009; Autism Developmental Disabilities Monitoring Network Surveillance Year Principal Centers for Disease Prevention, 2012). An increased incidence was also reported in Israel (Davidovitch et al., 2013). If this is correct, it may largely result from prenatal environmental causes because genetic, ethnic, socioeconomic, and geographic factors did not change significantly during that time. Recent meta-analysis of seven studies including 1,140,210 children evaluated the association between inter-pregnancy interval and increased risk of ASD, and found OR of 1.9 for interval <12 months and 1.37 interval >5 years. Proposed mechanisms included folate deficiency, maternal stress, and sustained post-partum inflammation from previous pregnancy for short interval and infertility, unintended pregnancy, and inflammation for long one (Conde-Agudelo et al., 2016). Genetic predisposition was offered by Darbro et al. who found decreased risk of cancer among ASD patients. Despite increased prevalence of rare coding single-nucleotide variations in oncogenes they tend to develop fewer neoplasms. They hypothesized that the protective effect may be due to defects in cellular proliferation and aging (Darbro et al., 2016). The prenatal causes of ASD can be divided into environmental chemicals (i.e., drugs such as valproic acid, thalidomide, misoprostol; alcohol, cocaine, and toxic metals taken by the mother during pregnancy), exposure to particulate matter air pollution of up to 2.5 micron in diameter (PM2.5), maternal infections during pregnancy (i.e., rubella, CMV), maternal and fetal inflammation (Fox et al., 2012) and maternal diseases (i.e., diabetes mellitus), including autoimmune diseases (Brown et al., 2015) or allergic diseases such as asthma (Croen et al., 2005). In addition, perinatal factors such as perinatal asphyxia, IUGR, RDS, and others were also associated with an increase in the prevalence of ASD (Gardener et al., 2011). Numerous mechanisms for ASD have been offered, based also on experimental animal models. In addition to complex genetic susceptibility, epigenetic changes have also been proposed (Kogan et al., 2009). Other mechanisms are: immune dysregulation that include abnormal levels of cytokines and growth factors and various fetal and maternal antibodies to brain tissue (Rossignol and Frye, 2012). Additional proposed mechanisms are increased oxidative stress, mitochondrial dysfunction, abnormalities in brain serotonin, abnormal white matter connectivity, decrease number of Purkinje cells in the cerebellum, and neuronal migration defects (Billeci et al., 2012; Grabrucker, 2012; Rossignol and Frye, 2012). The purpose of the present review is to summarize the data describing genetic syndromes with ASD like behavior and the maternal diseases associated with increased prevalence of ASD. In addition, we summarize the antenatal injurious factors that are known to be related to the etiology and pathogenesis of ASD.

اسید فولیک باعث افزایش فعالیت خزان یاخته ای و ژنوتوکسیک کربوپلاتین در سلول HeLa می شود

Folic acid enhances the apoptotic and genotoxic activity of carboplatin in HeLa cell line

Abstract

In human tumor cells, experimental and clinical evidence indicates that some factors involved in signal transduction and cell growth can also modulate the response to chemotherapeutic treatment. The aim of the present study was to investigate the role of folic acid (FA) as a modulator of carboplatin (CBDCA) activity.

Genotoxicity and cytotoxicity induced by CBDCA alone and in combination with FA were assessed in cultured HeLa cells. We used comet assay, mitotic index analysis, MTT and NR assays, cytokinesis-block micronucleus cytome assay and annexin V-IP as different cytotoxicity and genotoxicity approaches for human cervical carcinoma cell line studies.

The results showed that addition of 900 nM FA together with 40.4 mM CBDCA enhanced the activity of the platinum compound, increasing its effect on cell death by nearly 20%, as evidenced by the MTT and NR assays. Moreover, not only higher levels of DNA and chromosomal damage were reached but also the number of necrotic and apoptotic cells were significantly increased when cell cultures were treated with the combined procedure.

This situation opens the possibility to explore the use of FA in platinum-based chemotherapy protocols to reduce the platinum doses for patient treatment and decrease the chance of developing the known side effects without losing biological activity.

1 Introduction

Platinum-based compounds are known since the 19th century. In fact, cisplatin was first synthesized in 1845, but the discovery of its antitumor properties was not made until 1969 (Rosenberg and Vancamp, 1969). Today, platinating compounds are still front-line clinical therapies and constitute part of the treatment regimen for patients with many types of cancers, including head and neck, testicular, ovarian, cervical, lung, colorectal and relapsed lymphoma. Despite this success, nephrotoxicity, neurotoxicity and the emetic properties of cisplatin have limited its use (Basu and Krishnamurthy, 2010). Also, the reduced water solubility, the relatively narrow range of treatable cancers and the ability of carcinomas to develop chemotherapy resistance have pressed researchers to develop a new generation of platinum-based molecules. In this sense, carboplatin (CBDCA) is a second generation drug introduced and approved by the FDA in the late 20th century. Since that time, it has gained popularity in clinical treatment due to its reduced side-effects, when compared with its related compound cisplatin. Particularly, although CBDCA has low nephrotoxicity effects, it shows undesirables myelosuppressive characteristics (Wagstaff et al., 1989).

Even though platinum-based compounds have the ability to bind to a wide spectrum of biomolecules, such as RNA, proteins or phospholipids, DNA is their main biological target (Pascoe and Roberts, 1974; Knox et al., 1986). Cisplatin and CBDCA can enter cells via passive diffusion through a process known as aquation (Gately and Howell, 1993), or via endocytosis using the copper transporter CTR1, which is a key influx transporter and plays an important role in mediating the uptake of platinum compounds (Shen et al., 2012). Once into the cells, platinum compounds bind to the nitrogens of purine bases in DNA, inducing intrastrand crosslinks. The presence of these adducts distorts the double helix, blocking DNA replication and transcription (Jamieson and Lippard, 1999). Specifically, CBDCA mostly forms the intrastrand crosslink cis-Pt(NH3)2d(pGpG)(Pt-GG), requiring N200-fold CBDCA than cisplatin to obtain equal levels of platination. On the other hand, N20 times CBDCA is needed to obtain equal levels of cytotoxicity in CHO cells, after 1 h of exposure (Blommaert et al., 1995). To treat locally advanced cervical cancer, platinum-containing agents are used alone or in combination. Some studies have shown that the use of cisplatin combined with paclitaxel requires a prolonged infusion and is less convenient and more toxic than the combination of CBDCA and paclitaxel, thus leading to a more widespread use of CBDCA (Moore et al., 2007).

Folate, or folic acid (FA), is a water-soluble B-vitamin also known as vitamin B9 or folacin. In nature, folates exist in a wide range of chemical forms and they can be found in food as well as in metabolically active forms in the human body. FA is the major synthetic form found in fortified foods and vitamin supplements; however, it has no biological activity unless converted into folate (National Academy Press, 1998). In human physiology, the only function of folate coenzymes appears to be linked to the transfer of one-carbon units, playing a major role in Sadenosylmethionine formation, the universal methyl donor, as well as in the construction of purine and thymidine in a variety of reactions critical to the metabolism of nucleic acids and amino acids (Bailey and Gregory, 1999; Choi and Mason, 2000).

Epidemiologic data have revealed that a reduced folate status is associated with cervical, colorectum, lung, esophagus, brain, pancreas, and breast cancer. Intervention trials using supraphysiologic doses of folate, mainly with individuals at increased risk of cervical and colorectum cancer, showed inconsistent results (Choi and Mason, 2000). Nevertheless, folates appear to be essential for cell growth and cell cycle, key processes in cell transformation. On the other hand, folate deficiency induces lower proliferation rates by increased apoptosis and cell cycle arrest (Courtemanche, 2003). It has been widely demonstrated that folate receptor is overexpressed in several human epithelial cancer cells, but is absent or negligibly expressed in most normal cells, highlighting the need for folates by transformed cells. In general, aggressive cancer types express the highest amounts of folate receptor alfa or FRα (Hansen et al., 2015).

In human tumor cells, experimental and clinical evidence indicates that some factors involved in signal transduction and cell growth can also modulate the response to chemotherapeutic treatment (Toffoli et al., 1998). For example, the cellular transformation by different oncogenes can stimulate the proliferation of ovarian cancer cells and confer cellular resistance to cisplatin (Basu and Cline, 1995). In this way, an increased folate internalization may have a role in the constitutive control of cell proliferation (Sun et al., 1995), thereby modifying the response to chemotherapeutic agents.

Human cervical carcinoma HeLa cells strongly express the folate receptor, as demonstrated in several works (Zhang et al., 2006). In this context, the use of folate as a cell response modulator against a chemotherapeutic agent is fully grounded, thus allowing the use of these cells as a model for studying the cellular response to a chemotherapeutic agent modulated by FA.

In this paper, we investigate the genotoxicity and cytotoxicity induced by CBDCA alone and in combination with FA. We used alkaline single cell gel electrophoresis assay (SCGE), mitotic index analysis (MI), 3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and cytokinesis-block micronucleus cytome (CBMN Cyt) assay as different cytotoxicity and genotoxicity approaches for human cervical carcinoma cell line studies.