خانواده ژن Aux/IAA در گیاهان: ساختار مولکولی، تنظیم و عملکرد

Aux/IAA Gene Family in Plants: Molecular Structure, Regulation, and Function

چکیده
1-مقدمه
2- شناسایی، تکثیر ژن، و ساختار مولکولی پروتئین Aux / IAA در گیاهان
3- برهمکنش پروتئین Aux / IAA در گیاهان
4- پروتئین Aux / IAA ممکن است در سطوح مختلف تنظیم شود
5- نقشهای عملکردی ژنهای Aux / IAA در طی روند رشد و رشد گیاهان
6-نتیجه گیری ومطالعات اینده

چکیده
 اکسین نقش مهمی در پاسخ های سلولی و رشدی گیاهان در طول عمر خود ایفا می کند. گیاهان سریعا قادر به پاسخ به تغییرات در سطوح اکسین هستند و این پاسخ ها شامل چندین دسته اصلی از ژن های حساس به اکسین از جمله اکسین / اندول -3 اسیدهای اسید (AUX / IAA)، خانواده فاکتور پاسخ اکسین، RNA اکسین کوچک تنظیم نشده(SAUR) و خانواده حساس به اکسین Gretchen Hagen3(GH3) می باشند. پروتئین های Aux/IAA پروتئین های هسته ای کوتاه عمر می باشند که شامل چندین حوزه یا دامنه حفاظت شده هستند که توسط خانواده پاسخ ژن اولیه اکسین کد گذاری می شوند. این پروتئین ها دامنه های خاصی دارند که با ARF ها برهمکنش دارند و مانع از رونویسی ژن های فعال ARF ها می شوند. مطالعات مولکولی نشان داده است که اعضای خانواده Aux / IAA می توانند دیمر های متنوعی با ARF ها را برای تنظیم ژن ها به روش های مختلف تشکیل دهند. تجزیه و تحلیل عملکردی اعضای خانواده Aux / IAA نشان داده است که آنها نقش های مختلفی در توسعه گیاهان مانند رشد ریشه، رشد ساقه و رسیدن میوه دارند. در این بررسی، به تازگی کشف شده در مورد مشخصات مولکولی، مقررات، و پروتئین پروتئین برهمکنش پروتئین Aux / IAA مورد بحث قرار گرفته است. این جزئیات بینش جدیدی را در مورد مولکولی عملکرد Aux / IAA در پروسه های رشد گیاه فراهم می کند.
1- مقدمه
در گیاهان، بسیاری از فرایندهای تکاملی، از قبیل تشکیل بافت آوندی، ایجاد ریشه اتخاذ، پاسخهای تروپیستیک، غالبیت راسی، و رشد گل و میوه، به طور دقیق توسط اکسین تنظیم شده است. اکسین نیز بر فرآیندهای سلولی مانند تقسیم سلولی، بزرگ شدن و تمایز تأثیر می گذارد. [1-4]. تغییرات مکانی و مکانی دینامیکی در سطوح اکسین می تواند به طور دقیق و سریع به برنامه ریزی ژن منجر شود که نیازمند واکنش زودهنگام اکسین، مانند خانواده اکسین/ ایندول 3- استیک اسید(Aux / IAA)، فاکتور پاسخ اکسین (ARF) RNA (SAUR) کوچک شده با اکسین (SAUR)، آمینوسیکل پروپان 1-کربوکسیلیک اسید سنتاز (ACS)، گلوتاتیون S-ترانسفراز مانند GH2 / 4 و خانواده هژن 3 (GH3) [3، است. در میان این ژن ها، اعضای خانواده Aux / IAA به عنوان پروتئین های هسته ای کوتاه مدت شناخته شده اند که نقش مهمی در سرکوب سطوح بیان ژن های فعال ARF ها ایفا می کنند (7-8) همچنین نشان داده شده است که تنظیم رونویسی شده توسط اکسین منحصرا به عملکرد Aux / IAA وابسته است (9) پروتئین های Aux / IAA برای اتصال به ARF ها پیشنهاد شده اند و از عدم فعال شدن ژن های واکنش اکسین در غیاب اکسین جلوگیری می کنند. در سطوح بالای اکسین، این پروتئین ها می توانند با ارتباط با گیرنده های AUXIN (TIR1 / AFB) و سپس از طریق پروتئازوم 26S [10-12] تخریب شوند ARF های منتشر شده بیان عبارات ژن های واکنش اکسین را تنظیم می کنند (10)
ترکیبات مختلف پروتئینی TIR1 / AFB-AUX / IAA معمولا دارای وابستگی متفاوتی به اکسین هستند و سطوح اکسین در بافت های مختلف و فازهای رشد متفاوت است که منجر به اثرات متمایز کننده اکسین می شود (9،11،13،14) بنابراین، تغییر دینامیکی فضایی و زمانی در سطوح اکسین می تواند به صورت سیگنالینگ مجدد برنامه ریزی ژنی تبدیل شود، در نتیجه تنظیم فرآیندهای رشد و رشد گیاه به روش دقیق را به دنبال دارد.
در دو دهه گذشته جهش در ژنهای Aux / IAA در آرابیدوپسیز به شدت مورد مطالعه قرار گرفته است و این مطالعات نشان داده است که اعضای این خانواده در فرآیند رشد و رشد گیاهان متمایز هستند [15-18]. تا به امروز، 29 عضو خانواده Aux / IAA در آرابیدوپسیز جدا شده اند [18-20]. در همین حال، بسیاری از ژنهای نامزد که به طور بالقوه ثبات پروتئین Aux / IAA را تنظیم می کنند نیز شناسایی شده اند [21،22]. قابل توجه است که تعداد زیادی از اعضای خانواده Aux / IAA نیز در سایر گیاهان از جمله اکالیپتوس گرندیس، لاکوپرسیکون Solanum، Cucumis sativus، Populus trichocarpa، Zea mays و Oryza sativa [23-29] شناسایی شده است. به تازگی، از طریق روش ترکیبی از روش های فیزیولوژیکی، ژنتیکی، مولکولی و بیوشیمیایی، به طور فزاینده اطلاعات جدیدی در مورد مکانیسم های Aux / IAA در تنظیم ترشح سیگنال اکسین و تخریب اکسین به دست آمده است و این اطلاعات فرصت های ارزشمند برای روشن ساختن توسعه فرآیندهای تنظیم شده توسط سیگنالینگ اکسین در گیاهان. در این بررسی، پیشرفت های اخیر در نقش Aux / IAA در تنظیم رشد و پیشرفت گیاه، و همچنین بینش های جهانی و جدیدی در زمینه مکانیزم های مولکولی این فرآیند، ارائه شده است.

Abstract

Auxin plays a crucial role in the diverse cellular and developmental responses of plants across their lifespan. Plants can quickly sense and respond to changes in auxin levels, and these responses involve several major classes of auxin-responsive genes, including the Auxin/Indole-3-Acetic Acid (Aux/IAA) family, the auxin response factor (ARF) family, small auxin upregulated RNA (SAUR), and the auxin-responsive Gretchen Hagen3 (GH3) family. Aux/IAA proteins are short-lived nuclear proteins comprising several highly conserved domains that are encoded by the auxin early response gene family. These proteins have specific domains that interact with ARFs and inhibit the transcription of genes activated by ARFs. Molecular studies have revealed that Aux/IAA family members can form diverse dimers with ARFs to regulate genes in various ways. Functional analyses of Aux/IAA family members have indicated that they have various roles in plant development, such as root development, shoot growth, and fruit ripening. In this review, recently discovered details regarding the molecular characteristics, regulation, and protein–protein interactions of the Aux/IAA proteins are discussed. These details provide new insights into the molecular basis of the Aux/IAA protein functions in plant developmental processes.

1- Introduction

In plants, many developmental processes are finely tuned by auxin, such as vascular tissue formation, adventitious root initiation, tropistic responses, apical dominance, and flower and fruit development. Auxin also affects cellular processes, such as cell division, enlargement, and differentiation [1–4]. Dynamic spatial and temporal changes in auxin levels can trigger gene reprogramming precisely and rapidly, which requires auxin early response genes, such as the Auxin/Indole-3-Acetic Acid (Aux/IAA) family, the auxin response factor (ARF) family, small auxin upregulated RNA (SAUR), aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase (ACS), glutathione-S-transferase (GH2/4-like), and the auxin-responsive Gretchen Hagen3 (GH3) family [3,5,6]. Among these genes, Aux/IAA family members have been identified as short-lived nuclear proteins that play a crucial role in repressing the expression levels of genes activated by ARFs [7,8]. It has also been demonstrated that auxin-mediated transcriptional regulation is exclusively dependent on the functions of Aux/IAA [9]. Aux/IAA proteins have been suggested to bind with ARFs and prevent activation of auxin-responsive genes in the absence of auxin. At high auxin levels, these proteins can be ubiquitinated by interacting with TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1/AUXIN SIGNALING F-BOX (TIR1/AFB) receptors and subsequently degraded via the 26S proteasome [10–12]. The released ARFs regulate the expression of auxin-responsive genes [10]. The different TIR1/AFB-Aux/IAA protein combinations usually have differential auxin-binding affinities, and the auxin levels are different in different tissues and developmental phases, which results in distinct auxin-sensing effects [9,11,13,14]. Thus, the spatial–temporal dynamic change in auxin levels can be finely transformed into gene reprogramming signaling, thereby regulating the processes of plant growth and development in a precise manner.

Over the past two decades, mutations in Aux/IAA genes have been intensely studied in Arabidopsis, and these studies have revealed that the members of this family display distinct functions in plant growth and development processes [15–18]. To date, 29 Aux/IAA gene family members in Arabidopsis have been isolated [18–20]. Meanwhile, many candidate genes that potentially regulate the stability of Aux/IAA proteins have also been identified [21,22]. It is noteworthy that a large number of Aux/IAA family members have also been identified in other plants, including Eucalyptus grandis, Solanum lycopersicon, Cucumis sativus, Populus trichocarpa, Zea mays, and Oryza sativa [23–29]. Recently, through the combined application of physiological, genetic, molecular, and biochemical methods, increasingly abundant new information regarding the mechanisms of Aux/IAA in regulating auxin signal transduction and auxin degradation has been obtained, and this information provides valuable opportunities to clarify the developmental processes fine-tuned by auxin signaling in plants. In this review, recent advances in the roles of Aux/IAA in regulating plant growth and development, as well as global and new insights into the underlying molecular mechanisms of these processes, will be presented..

خانواده ژن Aux/IAA در گیاهان: ساختار مولکولی، تنظیم و عملکرد

Aux/IAA Gene Family in Plants: Molecular Structure, Regulation, and Function

مقالات انگلیسی و ترجمه های فارسی رایگان با فرمت PDF آماده دانلود رایگان میباشند

همچنین ترجمه مقاله با فرمت ورد نیز قابل خریداری و دانلود میباشد

مقاله انگلیسی رایگان (PDF)

ترجمه فارسی رایگان (PDF)

خرید ترجمه با فرمت ورد

فهرست مقاله:

مقدمه
تاریخچه ای کوتاه
بیوژنز و عملکرد miRNA
miRNA و تنظیم ترجمه
آغاز ترجمه
MiRNAs و سرطان
نتیجه گیری

بخشی از ترجمه فارسی مقاله:

 مقدمه
پیشرفت های اخیر در تحلیل ترانسکریپتوم و فناوری های مولد و پرتون نشان دهنده پیچیدگی بالای دنیای RNA است. شناخته شده ترین مناطق RNA، ژن های کد کننده پروتین، MicroRNAs، می باشند که 1.5 درصد ژنوم انسان را شامل می شوند. اهمیت MicroRNAs کد کننده کاملا شناخته شده است زیرا به مدت سالیان مختلف پایه و اساس زیست شناسی تجربی بوده است و به تشخیص سیستمی ژن های کد کننده در گونه های مختلف انجامیده است. در عین حال رتروترانسپوزون ها، عناصر ژنتیکی به تنظیم بیان ژن کمک می کنند. چون RNA به عنوان مسئله اصلی تنظیم ژنتیکی محسوب می شود، ایده حاوی اطلاعات اساسی به کلاس های جدیدی از RNA توسعه داده شده است. اخیرا، بخش کد کننده غیر پروتینی توجه زیادی را به دلیل نقش غیر منتظره خود در تظیم رشد و بیماری کسب کرده است. امروزهف بیشتر دانشمدان بر این باور هستند که رونویسی ژنوم انسان بسیار وسیع است و این مسئله موجب افزایش سوالاتی در خصوص کارکرد RNA ها می شود.
کشف RNA های غیر کد کننده موجب تغییر شیوه نگرش ما به ژنوم انسان شده و جهان علم را قادر به شناسایی انواع متفاوتی از ncRNAs در سلول های انسانی کرده است. اگرچه یک مرز مشخصی از کلاس های ncRNAs وجود ندارد، آنها بر طبق طول نوکولئوتید شان در سه گروه اصلی طبقه بندی می شوند: ncRNAs های کوتاه، ncRNAs های با اندازه متوسط و ncRNAs های با طول بلند. در میان ncRNAs های کوتاه، می توان بین microRNAs و RNAs (piRNAs) انتخاب کرد و به ترتیب دارای 19 تا 25 جفت باز و 26-31 جفت باز است. miRNAs در تنظیم بیان زن در سطح پایداری و ترجمه نقش دارد، در حالی که piRNAs در متیلاسیون DNA و مهار ترانسپوزون نقش دارد.RNA های هسته ای کوچک، بخشی از RNA های با اندازه متوسط بوده و به عنوان راهنمایی برای اصلاحات Rrna عمل می کند. lncRNAs در چندین فرایند پاتولوژیکی و بیولوژیکی نظیر نقش پذیری ژنومی، تنظیم تلومر، غیر فعال سازی کروموزوم ایکس ، رشد، چند توانی سلول های بنیادی، تنظیم ایمنی، پیشرفت سرطان و پتانسیل متاستاز ایفا می کنند. به طور ویژه، یک زیرمجموعه ای از ncRNAs، T-UCR، میکرو RNA ها را هدف یابی می کنند. ارتباط بین این lncRNAs و microRNAs مانع از تجزیه رونویسی می شود. لازم به ذکر است که تعریف ncRNAs بستگی به ابزار های بیو انفورماتیک دارد که در آینده ای نزدیک به چالش کشیده می شود. به طور ویژه، قالب های باز خواندن کوتاه تر از 100 نوکلوتید و یا فاقد توالی ATG قوی برای شروع ترجمه، به صورت غیر کد کننده در نظر گرفته می شود. از حیث ظهور مکان های شروع ترجمه جایگزین، می توان کشف کرد که حداقل برخی از ncRNAs ها برای پپتید های کوچک کد کننده هستند.
اهمیت ترانسکریپتوم غیر کد کننده در درک بیماری های انسانی با تعداد زیادی از ncRNAs ها که به طور ناهنجار در سرطان، بیماری قلبی و عصبی یا اختلالات ایمنی بیان می شوند برجسته تر می شود. در این رابطه، RNAs های کوچک توجه بسیاری از محققان را جذب کرده است. از این روی ما بر microRNAs و نقش آن ها در تنظیم ترجمه و سرطان تاکید می کنیم. در نهایت ما به بررسی بیان microRNAs در سرطان و پتانسیل آن ها در تولید دارو های جدید می پردازیم.
MicroRNAs: کشف و بیوژنز
تاریخچه ای کوتاه
MicroRNAs ها RNA های تک رشته ای و غیر کد کننده با 19 تا 25 نوکلوتید طول می باشند که هم در جانوران و هم در گیاهان یافت شده و در عین حال در تنظیم رونویسی نقش دارند. دو دهه پیش، وجود microRNAs مبهم بود و جامعه علمی بر ژن های کد کننده پروتین تاکید داشتند.
با این حال در 1993، به مدت هفت سال پس از کشف lin-4 RNA، ژنومیک این نوع RNA تنظیم کننده ساده تر شده است به طوری که هیچ شاهدی برای RNA های شبه lin-4 فراتر از نماتد ها وجود نداشته و علایم RNA های غیر کد کننده مشابه درون نماتد ها وجود نداشته است. این مورد همگی منجر به کشف LET7 شده است که یک ژن دیگر در مسیر هتروکرونیک الگانس بوده و دومین RNA تنظیم کننده 22 نوکلوتیدی را کد گذاری کرده است. let 7 RNA موحب افزایش انتقال و کذار از مرحله اواخر لاروی به سلول های بالغ همانند LIN-4می شود. به علاوه، همولوگ های ژن Let7 در انسان و ژنوم مگس، و let 7 RNA در انسان ، مگس سرکه شناسایی شده است( راسکالینی و همکاران 2000).جهش در این ژن با بر هم زدن نظم در مراحل رشد و نمو، موجب عدم تغییر سلول های جنینی از اولین مرحله لاروی L1 به مراحل بعدی می شود. محققان بر این باورند که از ژن Lin-4 پروتینی سنتز نمی شود و به جای آن دو نوع RNA کوچک ساخته می شود:یک RNA کوتاه 22 نوکلوتیدی Lin-4-s و RNA دیگری که طول بیشتری در حدود 60 نوکلوتید دارد. مطالعات بعدی توسط وایتمن نشان داده است که ژن Lin-4 تنظیم کننده منفی ژن Lin-14 می باشد. ژن اخیر پروتینی با عمر کوتاه تولید می کند و در نمو جنین کرم نقش دارد. نکته جالب، تلاقی زمانی کارکرد تنظیمی و غیر مداوم Lin-4 RNA و با بیان پروتین LIN-14 می باشد. در واقع با حضور Lin-4 RNA، میزان پروتین LIN-14 تا بیست برابر کاهش می یابد. تحقیقات امبروس و راکون نشان داده است که در بخش 3 UTR، در m-RNA ژن Lin-4، قسمت های مختلفی وجود دارند که از نظر توالی مکمل توالی Lin-4 RNA می باشند. هم چنین ادامه تحقیقات نشان داد که اتصال بین این دو مولکول RNA، دلیل اصلی اثر منفی Lin-4 RNA و Lin-14 m-RNA است. به علاوه اتصال ذکر شده تنها موجب کاهش میزان پروتین LIN-14 می شود و بر مقدار Lin-14 MRNA هیچ تاثیری ندارد. به مدت هفت سال، از 1993 تا 2000، Lin-4 تنها مولکول RNA شناخته شده ای بود که با اتصال به مولکول RNA دیگر، بیان پروتین آن را مهار می کرد. ولی در 2003، پژوهش رینهارت و همکاران منجر به کشف RNA جدید موسوم به LET-7 در نماتود الگانس شد که نقش مشابه با LIN-4 داشت.

بخشی از مقاله انگلیسی:

INTRODUCTION

Recent advances in transcriptome analysis and high throughput technologies highlighted an impressive complexity in the RNA world. The most studied RNA regions are protein-coding genes, mRNAs, accounting for around 1.5% of the human genome[1]. The importance of coding mRNAs is undisputable as they have been for years the building brick of experimental biology, culminating in the systematic deletion of coding genes in several species. Not less important are retrotransposons, specific genetic elements which are known to regulate gene expression[2,3]. Since RNA was identified as the crux of genetic regulation, the idea that it carries fundamental information has been extended to novel classes of RNA. More recently, the nonprotein coding portion of the genome gained attention due to its unexpected role in regulating development and disease[4]. Nowadays, most scientists agree in stating that transcription of the human genome is pervasive, therefore raising questions on the function of many uncharacterized RNAs. The discovery of non-coding RNAs (ncRNAs) has changed the way we look at the human genome and led the scientific world to characterize the different types of ncRNAs transcribed in human cells. Although there is not a clear delineation of ncRNA classes, they are usually classified, according to their nucleotides length, in three main groups: Short ncRNAs, mid-size ncRNAs and long ncRNAs[5]. Among short ncRNAs we can distinguish between microRNAs (miRNA) and piwiinteracting RNAs (piRNAs), respectively 19-25 base pairs (bp) and 26-31 bp long. miRNAs are involved in the regulation of gene expression at the translational and stability level[6-8], while piRNAs are involved in DNA methylation and transposon repression[9-11]. Small nucleolar RNAs (60-300 bp) are part of mid-size RNAs and act as guides for rRNA modifications[12], Promoter Associated RNAs (22-200 bp) belong to the same group but their function is obscure[13]. Last but not least, long non-coding RNAs (lncRNAs) comprise all ncRNAs longer than 200 nucleotides and include the largest portion of the non-coding transcriptome[4]. lncRNAs are involved in several biological and pathological processes, such as genomic imprinting, telomere regulation, X-chromosome inactivation, development, stem cell pluripotency, immune regulation, cancer progression and in metastatic potential[14,15]. In particular, a subset of lncRNAs, the T-UCR, themselves target specific miRNAs. The binding between these lncRNAs and miRNAs prevents target transcription degradation determining an intricate coregulation between lncRNAs and miRNAs[16-18] and strictly linking these two different types of ncRNAs. It should be however stressed out that the definition of ncRNA relies mainly on bioinformatic tools that are likely to be challenged in the next future. In particular, open reading frames (ORF) shorter than 100 nucleotides and/or lacking a strong ATG consensus sequence for translational start are considered noncoding. In view of the emergence of alternative translational start sites[19], we may discover that at least some ncRNAs are indeed “coding” for small peptides. The relevance of the non-coding transcriptome in the comprehension of human diseases is highlighted by the impressive number of ncRNAs that are abnormally expressed in cancer, in neurological and heart diseases or in immune disorders. In this context, short RNAs have attracted the attention of most researchers. Here, we focus on miRNA and on their role in translation regulation and cancer. In particular we zoom in the known mechanisms of miRNA-regulated translation, after a brief elucidation of their discovery and biogenesis. Finally, we account for the aberrant expression of miRNAs in cancer and for their therapeutical potential as new drugs.

miRNA: DISCOVERY AND BIOGENESIS

A brief history miRNAs are endogenous, non-coding single stranded RNAs of approximately 19-25 nucleotides in length, found both in animals and plants and involved in post transcriptional regulation[7,20]. Two decades ago the existence of miRNAs was obscure and the scientific community was focused largely on protein-coding genes. However in 1993 the discovery of the first small ncRNA lin-4, in C. elegans, has totally changed the scientists’ point of view[21]. At the time of the first discoveries, two main questions were raised: (1) what is the role of lin-4; and (2) what is its mechanism of action? Genetic studies showed that lin-4 is one of the most relevant genes involved in the control of temporal development of larval stages[22,23]. Almost simultaneously, Lee and collaborators discovered that null mutations of the lin-14 gene were able to cause an opposite phenotype to null lin-4 mutations, suggesting that lin-4 could regulate lin-14[23,24]. How was this regulation taking place? Several groups unequivocally demonstrated that the introduction of mutations in the putative ORF of the lin-4 gene, did not affect its function, concluding that lin-4 did not encode for a protein. Mature lin-4 was found to be present in two small transcripts with different lengths, 22 and 61 nucleotides[24]. Furthermore, mutations in the 3’UTR of lin-14 mRNA and gene fusion experiments showed that lin-14 was downregulated posttranscriptionally by lin-4, delineating the 3’UTR of lin-14 as necessary for the regulation of LIN-4 protein levels[25,26]. These data led to a unified conclusion: lin-4 transcripts were complementary to the 3’UTR of the lin-14 gene and regulated its expression by annealing to its 3’UTR. With a similar approach, seven years later another miRNA was discovered, let-7, which was able to regulate lin-41 expression by binding to its 3’UTR[27,28]. Further, the sequence of let-7 was found conserved among species, from flies to humans. A new era in transcriptomics was now open for study by the entire scientific world!

نقش میکرو RNA ها در تنظیم اسپرماتوژنز پستانداران

The roles of microRNAs in regulation of mammalian spermatogenesis

Abstract

Mammalian spermatogenesis contains three continuous and organized processes, by which spermatogonia undergo mitosis and differentiate to spermatocytes, follow on meiosis to form haploid spermatids and ultimately transform into spermatozoa. These processes require an accurately, spatially and temporally regulated gene expression patterns. The microRNAs are a novel class of post-transcriptional regulators. Cumulating evidences have demonstrated that microRNAs are expressed in a cell-specific or stage-specific manner during spermatogenesis. In this review, we focus on the roles of microRNAs in spermatogenesis. We highlight that N6-methyladenosine (m6A) is involved in the biogenesis of microRNAs and miRNA regulates the m6A modification on mRNA, and that specific miRNAs have been exploited as potential biomarkers for the male factor infertility, which will provide insightful understanding of microRNA roles in spermatogenesis.

1 Introduction

Male fertility is dependent upon the successful perpetuation of spermatogenesis that is a highly organized process of germ cell differentiation occurring within the seminiferous tubules in the testes. Spermatogonial stem cells (SSCs) are a subset of undifferentiated spermatogonia that are capable of self-renewal to maintain the pool of SSCs or differentiation to give rise to spermatogenic lineage, thus supporting the continuous production of spermatozoa. Spermatogenesis initiates once SSCs enter differentiation process [1]. The spermatogonia go into the meiotic phase and become spermatocytes. After a long-lasting meiosis I, preleptotene spermatocytes transform into second spermatocytes and enter meiosis II to produce haploid round spermatids [2], which undergo spermiogenesis including acrosomal biogenesis, flagellum development, chromatin condensation, cytoplasmic reorganization and exclusion [3]. Ultimately, the round spermatids transform into spermatozoa, which are released into the lumen of seminiferous tubules [4].

This highly organized spermatogenesis requires accurate, spatial and temporal regulation of gene expression governed by transcriptional, post-transcriptional and epigenetic processes [5, 6]. More than a thousand of protein coding genes that are involved in the spermatogenesis have been identified [7, 8]. However, the mechanisms that mediate the expression of these spermatogenesis-related genes have not been fully uncovered. The microRNAs (miRNAs, miR), small (~22 nucleotides) single-strand noncoding RNAs, are linked to cell proliferation, differentiation and apoptosis [9–11]. Transcriptome data indicate that miRNAs are extensively transcribed during spermatogenesis. The miRNAs are differentially expressed in a cellspecific and step-specific manner ([12, 13], Chen et al. unpublished data). Some miRNAs are specifically expressed in certain type of male germ cells, while the others are universally expressed among different types of cells in the testes. Growing evidences have showed that the miRNAs are essential for male germ cell development and differentiation [14–17]. A few recent reviews have reported the roles of miRNAs in spermatogenesis and fertility [5, 6, 10, 11]. In this article, we briefly summarize the most recent progress of miRNAs in the regulation of spermatogenesis.

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

تست های کشت سلولی
برای ارزیابی جذب سلولی کورکومین، سلول های سرطانی HeLa از موسسه پاسچر تهران، ایران خریداری شد. سلولها در محیط موسوم به Roswell Park Memorial ( شهری در نیو مکزیکو) با 10٪ سرم جنین گاوی و 1٪ پنی سیلین / استرپتومایسین در 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور CO2 کشت داده شدند. سلول ها با غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر آزاد کورکومین یا بارگیری و ترکیب شدند. پس از 24 ساعت، سلولهای مورد آزمایش با PBS شسته شدند و سپس تحت میکروسکوپ فلورسانس معکوس بررسی شدند. (ابزار نیکون، ملویل، نیویورک، ایالات متحده آمریکا). به منظور ارزيابي اثرات سيتوتوكسيك نيتروژن كركومين، فيبروبلاست هاي فوربك پوست انسان و سلول هاي HeLa با تراكم 103 × 7 ميكروليتر در صفحات 96 كيلويي بذر كشت داده شدند و با غلظت هاي متفاوت كركومين آزاد و كپسول شده به مدت 48 ساعت انكوبه شدند. سپس (MTT 5 میلی گرم بر میلی لیتر) به هر چاه اضافه شد و سلول ها در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 4 ساعت انکوباتور شدند. برای حل شدن رسوب فرانسان آبی، دی متیل سولفوکسید اضافه شد و جذب در 570 نانومتر توسط یک ارزیابی کننده ELISA (BioTek، Winooski، VT، USA) تعیین شد. 

رنگ آمیزی هسته ای
همانند آزمایش MTT، سلول از خط سلولی HeLa کشت شدند و به مدت 48 ساعت با NP خالص، کورکومین یا NPC های کورکومین انکوباتور شدند. سپس، سلول ها با PBS شسته شدند و با پروما فرمالدئید 4٪ ثابت به مدت 20 دقیقه ثابت می شدند. پس از شستشو با PBS، برای افزایش نفوذ پذیری، 0.2٪ Triton X-100 به مدت 20 دقیقه اضافه شد؛ در مرحله نهایی، رنگ آمیزی هسته ای به مدت 25 دقیقه با استفاده از DAPI (1 میکروگرم در میلی لیتر سانتا کروز بیوتکنولوژی، سانتا کروز، CA، USA) انجام شد و سلول ها تحت یک میکروسکوپ فلورسنت (نیکون) مشاهده شدند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز در زمان واقعی کمی (qRT-PCR)
سلول های HeLa به مدت 48 ساعت با NP های خالی، کورکومین و CF-ALG-STPP NPC (50 میکروگرم بر میلی لیتر) کورکومین انکوباتور شدند. سپس آنها با PBS شسته شدند و RNA با استفاده از کل کیت استخراج RNAیکتا تاجیز، تهران، ایران) بر اساس پروتکل تولید کننده استخراج شد. سنتز cDNA با استفاده از کیت رونویسی شده معکوس تجاری (یکتا تاجیز) انجام شد. در مجموع 20 میکرولیتر مخلوط واکنش حاوی 4/0 میکروگرم پرایمر جلو، 0.4 میکروگرم مبدل برگشتی، 2 میلی لیتر cDNA، 10 میکرو لیتر SYBR سبز PCR ترکیبی اصلی(یکتا تاجیز)، 0.4 میکرولیتر کربوکسی-ادرادامین (یکتا تاجیز) و 6.8 میلی لیتر RNase آب آزاد GAPDH به عنوان یک کنترل داخلی مورد استفاده قرار گرفت. سطح ویژگی ژن با روش Ct تجزیه و تحلیل شد. جدول S1 توالی پرایمر و دمای آنیلینگ را نشان می دهد.

تحلیل آماری
داده های آزمون MTT با استفاده از آزمون آماری t مستقل تجزیه و تحلیل شد. نتایج qRT-PCR با استفاده از تجزیه واریانس یک طرفه و سپس پس آزمون توکی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتايج به صورت ميانگين ± خطاي استاندارد ميانگين و p-value 0.05 به صورت آماري معني دار در نظر گرفته شدند.

نتایج
خواص نانوذرات CS -ALG -STPP NPC حاوی کورکومین
نتایج FE-SEM نشان داد که NP-CFC-ALG-STPP دارای کورکومین کروی و اندازه متوسط ~ 50 نانومتر است که با یکدیگر جمع و متراکم می شوند (شکل 1A. ). شکل 1B یک تصویر AFM و نمای سه بعدی آن را نمایش می دهد. مطابق با داده های FE-SEM، اندازه گیری نتایج AFM نیز نشان می دهد که ذرات دارای توزیع اندازه یکنواخت هستند و اندازه های متوسط نانوذرات کورکومین بارگذاری شده 50 نانومتر است (شکل 1C.)

تجزیه و تحلیل طیف سنجی FT-IR
شکل 2 طیف های FT-IR از کورکومین، CS-ALG-STPP و NC-ALG-STPP ترکیب شده کورکومین را نشان می دهد. در طیف نانوذرات CS-ALG-STPP، گروه وسیعی در 3،432 cm-1 به گروه هیدروکسیل و آمین مربوط می شود.

رئوس یا پیکهای نزدیک به 1630 و 1413 سانتیمتر مربع به ارتعاشات متقارن و نامتقارن کششی گروه های COO اختصاص یافته است. علاوه بر این، باند حدود 1،026 cm-1 متعلق به باندهای آمید است. اوج 1،087 cm-1 به علت وجود -CH-OH در الکل سیلیکونی و کشش C-O است. برای کورکومین، پیک در 3،478 سانتیمتر 1 مربوط به گروه های آمین است. پیک جذب در 1510 سانتیمتر مشاهده می شود که مربوط به ارتعاشات C = O و C = C کورکومین است.
علاوه بر این، پیک جذب برای باندهای دوگانه C = C در 1 627 cm-1 در این طیف به دلیل همپوشانی با اوج CS-ALG-STPP واضح نیست. شدت اوج نسبی نانوذراتCFC-ALG-STPP کورکومین کمی ضعیف است، که ممکن است به دلیل وابستگی کورکومین به گروههای کاربردی ماتریس CS-ALG باشد.

راندمان جذب
برای ارزیابی کارایی انکپسولاسيون، تجزیه HPLC بر روی محلول ریخته شده، محلول پس از شستشو با اتانول و مخلوط نانوذراتCS-ALG-STPP کرکومین در آب انجام شد. با محاسبه منطقه زیر پیک، بازده نهایی برای آماده سازی NP حدود 70٪ بود (شکل 3).

انتشار کورکومین در محیط آزمایشگاهی از CS -ALG -STPP NP
مشخصات آزمایشی دارو در یک زمان معین مورد بررسی قرار گرفت و درصد کورکومین آزاد شده از NP-CS-ALG-STPP با استفاده از منحنی استاندارد اندازه گیری شد. شکل 4 آزمایشی آزمایشی داروی NPc کرکومین را نشان می دهد. داده های ما نشان داد که 24٪ و 29٪ از کورکومین پس از 1 و 2 ساعت از NP ها ، به ترتیب آزاد می شوند. سپس، رهاسازی کنترل شده شديد تا 24 ساعت مشاهده شد و 53٪ از کورکومين بارور شده فيزيکي در اين دوره آزاد شد (شکل 4).

جذب کورکومین و نانوذرات CS -ALG -STPP
فرایند ایزوترم برای ارزیابی ظرفیت بارگیری کورکومین بر روی NP-CS-ALG-STPP انجام شد. شکل 5، ایزوترم جذب برای کورکومین و NP-CS-ALG-STPP را نشان می دهد. نتایج تجربی مناسب با معادلات ایزوترم لانگمویار، فروندلیچ، تمکین، الوویچ و لانگمویر فروندلیچ بودند. جدول 1 داده های ایزوترم جذب برای کورکومین را در NP-CS-ALG-STPP و پارامترهای تعادلی نشان می دهد. تجزیه و تحلیل رگرسیون نشان داد که در بین ایزوترم های ذکر شده، مدل ایزوترم لانگموری-فروندلیچ بیشترین خطی بودن را نشان می دهد (R2 = 992).

آزمایشات درون آزمایشگاهی
بر اساس فعالیت فلورسانس ذاتی کورکومین، جذب آن در سلول های HeLa، 48 ساعت پس از انکوباسیون NPC-ALG-STPP NPC کورکومین مورد بررسی قرار گرفت. تصاویر میکروسکوپی فلورسنس نشان داد که سلول های کنترل و آنهایی که با NP-CS-ALG-STPP انکوباتور به عنوان گروه آزمایشی خالی نانوذرات هیچ فعالیت فلورسانس نشان نمی دهد. در مقایسه با گروه های آزمایشی کنترل و خالی ناقل NP ، سلول های HeLa که با آزاد کورکومین یا NPC کروکومین (50 میکروگرم بر میلی لیتر) تحت درمان با فلورسانس سبز قرار گرفته اند (شکل 6A). در مرحله بعد، اثر سیتوتوکسی NPs کرکومین بارگذاری شده با استفاده از آزمون MTT ارزیابی شد. فیبروبلاست های پیش پوست انسان و سلول های HeLa به مدت 48 ساعت با دوزهای مختلف کربوکامین آزاد یا کورکومین بارگذاری نشده CS-ALG-STPP NP (6.25، 12.5، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلی لیتر) انکوباتور شدند. برای ارزیابی سمیت نارسایی های کورکومین بر روی سلول های طبیعی، فیبروبلاست های فورنچه پوست انسان کشت شدند و با غلظت های مختلف کورکومین نانوذرات ترکیبی با کورکومین به مدت 48 ساعت انکوباتور شدند. نتایج حاصل از MTT نشان داد که اثر سیتوتوکسیک قابل توجه در درمان سلول های کروموزوم طبیعی تحت درمان با نانوذرات کورکومین یا نانوذرات ترکیبی با کورکومین (شکل 6B) مشخص نشد. علاوه بر این، اثر سیتوتوکسی NP در بیماران مبتلا به سرطان HeLa مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آزمون زنده ماندن سلول نشان می دهد که NPs کرکومین بارگذاری شده، به ویژه دوز بالای آن ، اثر بازدارنده وابسته به دوز ، به تکثیر سلولی نسبت به گروه کوروکوم آزاد داشت (شکل 6B).

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب)

F1826

نوکلئاز انگشت روی (ZFN) به سرعت تبدیل به ابزار کارآمد برای ویرایش ژن شد که برای ایجاد پستانداران ترانسژن استفاده شد. همانطور که قبلا ذکر شد، اولین مورد از این گزارشات، در مورد تولید رت های knockout (Geurts و همکاران، 2009) بود. رت ها گونه های پستاندارانی هستند که در آن روش رویکرد کلاسیک هدف قرار دادن ژن به علت عدم وجود سلول های معادل ES رت امکان پذیر نبود. در واقع، سلول های ES رت چند ماه قبل از انتشار مطالعه رت knockout جدا شده بودند (Buehr و همکاران 2008). استفاده از ZFN برای تولید پستانداران ترانس ژنیک به سرعت در میان آزمایشگاه های متعدد منتشر شد (Remy و همکاران، 2010) و به زودی نشان داده شد که ZFN در آزمایشات ویرایش ژنوم در موش (Carbery و همکاران، 2010؛ Meyer و همکاران، 2010)، احشام ( یو و همکاران، 2011؛ لیو و همکاران 2013؛ Wei و همکاران، 2015) و خوک ها (Hauschild و همکاران، 2011؛ Carlson و همکاران، 2012؛ Kwon و همکاران 2013؛ چیان و همکاران 2015) با موفقیت همراه بوده است .
بزرگترین تأثیر ZFN احتمالا در گونه های دام بود، زیرا عدم وجود سلول های ES واجد شرایط خاص گونه، تغییرات ژنومی را که نیازمند رویدادهای HR بود را محدود می کرد (Petersen and Niemann 2015). نمونه های خوبی از ZFN برای برنامه های کاربردی دام، با گاوهای اصلاح شده ژنومی با افزایش مقاومت به ماستیت(التهاب پستان) نشان داده شده است (لیو و همکاران، 2014a، b) و یا خوک های اهلی که ژنوم آنها ویرایش شده و حامل یک واریانت ژن RELA مشتق از گراز با هدف انتقال خاصیت بهبودی مرتبط با تب خوک آفریقایی (Lillico et al 2016) هستند.
برنامه های کاربردی ژن درمانی با ZFN همچنین در کشت بافت (مثلا Overlack و همکاران 2012) بکار برده شدند و مورد بررسی قرار گرفتند . این برنامه ها شامل انتقال ساختارهای بیانی برای این نوکلئازهای کایمریک از طریق ذرات مرتبط با ویروس آدنو( (AAV بود (Ellis et al. 2013). به موازات همین، با این حال، برخی از پیامدهای ناخواسته کشف شد. به عنوان مثال، مشاهده شد که اختصاصیت توالی ZFN دقیق نیست و توالی های ژنومی مشابه (که off-targets نامیده می شود) نیز می تواند مورد هدف قرار گیرند و در نهایت با مولکول DNA اهدا کننده ترمیم شود،که این یکی از محدودیت های فعلی نوکلئاز ویرایش ژنوم را برجسته می کند (Radecke و غیره 2010). با این وجود، برخی از مطالعات پری کلینیک استفاده کننده از ZFN در سلول های انسانی تا مرحله آزمایشات بالینی پیشرفت کرده اند؛ همانطور که این مسئله با غیر فعال شدن CCR5 که کو رسپتور اچ آی وی است نشان داده است و توسط مقامات نظارتی ایالات متحده تصویب شده است (Maier et al 2013، Tebas et al.، 2014) .
به عنوان یک نکته نهایی برای این بخش، مشخص شد که متدولوژی ZFN برای آزمایشگاه های زیست شناسی استاندارد به راحتی قابل دسترس نیست و همچنین مقرون به صرفه نیست و این واقعیت ممکن است موفقیت و تاثیر ZFN را در ترانسژنزیس پستانداران محدود کند. در واقع، اگر چه برخی از پلتفرم ها باز برای تولید ZFN (Hermann و همکاران، 2012) ایجاد شد، اکثر آنها توسط شرکت هایی که دارای حق ثبت اختراع برای این فناوری بودند، تجاری شدند (Swarthout و همکاران، 2011).
افکتور نوکلئاز شبه فعال کننده رونویسی (TALEN)
در سال 2011، نوع جدیدی از نوکلئاز ویرایش کننده ژنوم ، که به عنوان افکتور نوکلئاز شبه فعال کننده رونویسی( (TALEN شناخته می شود، در این زمینه گزارش شده است، که نشان دهنده یک جایگزین بالقوه برای ZFN است. مشابه آنچه که برای ZFN ذکر شد، TALEN اولین بار برای تولید موش های knockout ، استفاده شد (Tesson et al.، 2011). با وجود اینکه برای هدفگیری ژن در موش ها از سال 1987 پرتکل استاندارد تعریف شد، ویرایش دقیق ژنوم در رت دهه ها امکان پذیر نبود و این مسئله به احتمال زیاد توضیح می دهد که چرا این فن آوری های جدید برای اولین بار در رت استفاده شد و در نهایت به موش منتقل شد. در واقع، به زودی پس از آن، استفاده از TALEN برای ویرایش ژنوم در موشها گسترش یافت، بطوری که تعداد زیادی از مدل های جدیدی knockout به سرعت ایجاد شد (Panda et al. 2013؛ Sung et al. 2013؛ Wang et al. 2013a؛ Wefers et al. 2013) . TALEN نیز برای تولید گونه های حیوانی که ژنوم آنها ویرایش شده (Carlson et al. 2012)، از جمله خوک ها (Xin et al. 2013)، بز (Cui و همکاران، 2015)، گوسفند و گاو (Proudfoot et al. 2015؛ Wei و همکاران 2015) و پریمت های غیر انسانی (Liu et al 2014a، b) استفاده شد. باز هم همانند آنچه که برای ZFN مشاهده شد، TALEN به عنوان ابزار قوی و قابل اعتماد برای چندین کاربرد بیوتکنولوژی و زیست پزشکی در دام ها شناخته شده است و به ویژه به عنوان یک استراتژی کارآمد برای تولید مدل های بزرگ حیوانات از بیماری های انسانی به کار گرفته شده است(Whitelaw et al 2016 ). برنامه های کاربردی کشاورزی با استفاده از TALEN شامل تولید گاوهای اصلاح شده ژنومی بدون شاخ ، مطابق با یک آلل جهش یافته طبیعی (Tan و همکاران 2013) و یا تولید گاو اصلاح شده ژنومی با افزایش مقاومت به سل است (Wu et al. 2015).
در حالی که TALEN دارای شباهت هایی با ZFN است، برخی تفاوت های جذاب نیز وجود دارد. هر دو ZFN و TALEN پروتئین های کایمریکی هستند که بوسیله اتصال یک DNA-binding domain با دمین اندونوکلئاز مشابه ، از رستریکشن آنزیم FokI ایجاد شده اند. آنها همچنین به عنوان دایمر عمل می کنند، بدین ترتیب یک جفت از ZFN یا TALEN همیشه باید در نظر گرفته شود تا مکان ژنومی مورد نظر را هدف قرار داهند. این به طور معمول از طریق الگوریتم های مبتنی بر وب به دست می آید که به محققان کمک می کند تا بهترین توالی های DNA هدف را در هر دو رشته در لوکوس هدف پیدا کنند. (Periwal 2016). با این حال، در حالی که ZFN به طور کامل در آزمایشگاه ، با اختصاصیت اتصال به DNA مشخص، بر اساس یک کد احتمالی که گروه های سه اسید آمینه ای را با سه نوکلئوتید لینک می کند، مهندسی شده است ؛ TALEN حاصل از پروتئین TALE است که در طبیعت وجود دارد و توسط برخی از پاتوژن های آلوده کننده گیاهی استفاده می شود تا آنها بتوانند دستگاه های سلولی را برای حمایت از چرخه زندگی پاتوژن به کار گیرند (موسولینیو و کاتومان 2012). از طریق بررسی سیستماتیک پروتئین های متعدد TALE، رمزگشایی یک کد مرتبط با دو آمینو اسید دقیق موجود در درون پروتئین با ظرفیت آن برای اتصال به یک نوکلئوتید مشخص، امکان پذیر بود (Bochtler 2012). بر خلاف ZFN، که به یک شرکت اختصاص داده شده بود و باید از طریق آن سفارش داده می شد، تولید TALEN مهندسی شده بصورت لوکال راحت بود. در واقع هر آزمایشگاه بیولوژی مولکولی می تواند به راحتی یک مجموعه بزرگ از عوامل واسطه ای را که به صورت پلاسمید در دسترس هستند، خریداری کند، که می تواند برای تولید TALEN سفارشی با استفاده از پروتکل کلونینگ گام به گام گلدن گیت بر اساس کاربرد ابتکاری از آنزیم های محدود الاثر نوع II برای سرهم بندی قطعات DNA مورد استفاده قرار گیرد ( DNA Cermak et al 2015، Sakuma و Yamamoto 2016). از لحاظ تئوری، کیت مونتاژ گلدن گیت و پروتکل آن، امکان طراحی و تولید آسان هر TALEN ای را مطابق با توالی DNA هدف فراهم می کند. در واقع، با این وجود، این فرایند می تواند طولانی و پر زحمت باشد زیرا پلاسمید های متعددی برای تولید یکی از این نوکلئازهای مهندسی شده مورد نیاز است. علاوه بر این، اینکه آیا TALEN نهایی، در نهایت می تواند توالی DNA مورد نظر را مورد هدف قرار دهد و آنرا برش دهد یا خیر ، متاسفانه غیر قابل پیش بینی باقی می ماند و تنها با تایید هر TALEN جدید تولید شده در آزمایشگاه و in vivo ( (Seruggia and Montoliu 2014) حل و فصل می شود.
افکتور نوکلئاز شبه فعال کننده رونویسی (TALEN) همچنین برای برنامه های ژن درمانی کاربرد دارد که در آن تعدادی از راهبردهای پری کلینیکال، از جمله سلول های بنیادی پرتوان انسانی القا شده (iPSC)، با موفقیت مورد بررسی قرار گرفته اند (به عنوان مثال Osborn et al. 2013؛ Ramalingam et al. 2014؛ Biffi 2015؛ Garate et al. 2015).
در زمینه ژنتیک موش، TALEN به عنوان یک ابزار ویرایش ژنوم امکان کاربردهای بزرگی را فراهم کرده است . بعنوان مثال یک مطالعه با هدف اصلاح جهش موثر بر عملکرد شبکیه ای که در ارتباط با موش های C57BL / 6N دیده می شود، انجام شد .این نوع موش ها یکی از شایع ترین گونه های موشی inbred هستند که در حال حاضر توسط کنسرسیوم بین المللی فنوتایپینگ موش مورد استفاده قرار می گیرد (IMPC؛ http: //www.mousefhenotype. org). این جهش غیر منتظره می تواند تفسیر فنوتیپ چشم موتاسیون های موشی اضافی تولید شده در پس زمینه ژنتیکی مشابه را مختل کند (Mattapallil et al.، 2012). محققان از TALEN برای اصلاح جهش های اختصاصی C57BL / 6 N در لوکوس Crb1 (آلل جهش یافته rd8) استفاده کردند و موشهای C57BL / 6N با ژنوم ویرایش شده بدون دژنراسیون شبکیه را تولید کردند (Low et al.، 2014).

تناوب‌هایِ کوتاهِ پالیندرومِ فاصله‌دارِ منظمِ خوشه‌ای( کریسپر) و پروتئین های مرتبط با کریسپر (Cas)
در سال 2013، جامعه علمی یک ابزار جدید ویرایش ژنوم با توانایی قابل ملاحظه ای برای ایجاد تغییرات ژنومی دقیق با راندمان بالا را کشف کرد و این سیستم در عین حال در هر آزمایشگاه بیولوژی مولکولی بسیار کاربردی بود. این تکنولوژی مخرب در سال 2012 توسط حداقل دو گروه مختلف (Jinek و همکاران 2012؛ Gasiunas و همکاران 2012) پیش بینی شده بود، اما تا سال 2013، زمانی که ظرفیت آن به عنوان یک ابزار قدرتمند ویرایش ژنوم قابل اثبات بود، خیلی مورد توجه نبود. تناوب‌هایِ کوتاهِ پالیندرومِ فاصله‌دارِ منظمِ خوشه‌ای( کریسپر) و پروتئین های مرتبط با کریسپر (Cas) اجزای یک سیستم ایمنی اکتسابی هستند که بیش از دو دهه پیش در پروکاریوتها کشف و بررسی شده است (Mojica and Montoliu 2016). سیستم CRISPR-CAS و یا ساده تر ابزار CRISPR، اولین بار برای آزمایش ژنوم در سلول های پستانداران در کشت مورد بررسی و استفاده قرار گرفت (Cong و همکاران 2013؛ مال و همکاران 2013) و کمی بعد از آن در موش مورد بررسی قرار گرفت (Wang et al. 2013b) . بلافاصله مشخص شد که این ابزار ویرایش ژنوم نسل سوم ساده ترین، قوی ترین و کارآمدتر از هر چهار روش نوکلئاز گزارش شده، یعنی meganucleases، ZFN، TALEN و CRISPR خواهد بود.
ابزار CRISPR از یک سیستم دفاعی اکتسابی که در بسیاری از آرکی ها و باکتری یافت می شود، مشتق شده است. به طور خلاصه، سیستم CRISPR نیاز به دو جزء اساسی دارد: یک مولکول کوچک RNA، که مسئول جفت شدن با توالی همولوگ DNA در سایت هدف است و یک Endonuclease DNA ، که DNA را برش می دهد و DSB منحصر به فرد را در محدوده انتخابی که توسط مولکول کوتاه RNA هدایت می شود، را تولید می کند. مولكول RNA کوچک ذکر شده در واقع معادل مولكول اصلی RNA كه توسط پروكاریوتها مورد استفاده قرار می گیرد یعنی crRNA و tracrRNA است و این RNA ها به ترتیب مسئول جفت شدن با توالی هدف و تعامل با Cas endonuclease هستند. دو مولکول کوچک RNA به صورت سنتتیک برای ایجاد یک RNA راهنما (sgRNA) و یا به اختصار gRNA توسط آزمایشگاههای جنیفر دوند و امانوئل چارپینتر در مقاله آنها در سال 2012 با هم ادغام شدند ، به این ترتیب این سیستم را که قبلا خودش نسبتا ساده بود، ساده تر می کند (Jinek et al.، 2012). شایع ترین ابزار CRISPR از سیستم CRISPR-CAS موجود در Streptococcus pyogenes مشتق شده است ، که در آن Cas endonuclease مربوطه، Cas9 است . به همین دلیل، ابزار CRISPR اغلب به عنوان CRISPR-Cas9 گزارش می شود. با این حال، از آنجایی که در حال حاضر ما می دانیم که انواع مختلفی از سیستم CRISPR در پروکاریوت ها وجود دارد، هر یک از آنها با مجموعه ای متفاوت از پروتئین های Cas (Makarova و همکاران 2015) همراه است، توصیه می شود به این ابزار ها به عنوان CRISPR-CAS یا حتی سادهتر، ابزارهای CRISPR اشاره شود (Mojica و Montoliu 2016).

اثر اختلال در اسکیزوفرنی 1 (DISC1) بر سیستم دوپامینرژیک: بررسی سیستماتیک

The impact of Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) on the dopaminergic system: a systematic review

Abstract

Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is a gene known as a risk factor for mental illnesses possibly associated with dopamine impairments. DISC1 is a scaffold protein interacting with proteins involved in the dopamine system. Here we summarise the impact of DISC1 disruption on the dopamine system in animal models, considering its effects on presynaptic dopaminergic function (tyrosine hydroxylase levels, dopamine transporter levels, dopamine levels at baseline and after amphetamine administration) and postsynaptic dopaminergic function (dopamine D1 and D2 receptor levels, dopamine receptor-binding potential and locomotor activity after amphetamine administration). Our findings show that many but not all DISC1 models display (1) increased locomotion after amphetamine administration, (2) increased dopamine levels after amphetamine administration in the nucleus accumbens, and (3) inconsistent basal dopamine levels, dopamine receptor levels and binding potentials. There is also limited evidence for decreased tyrosine hydroxylase levels in the frontal cortex and increased dopamine transporter levels in the striatum but not nucleus accumbens, but these conclusions warrant further replication. The main dopaminergic findings are seen across different DISC1 models, providing convergent evidence that DISC1 has a role in regulating dopaminergic function. These results implicate dopaminergic dysregulation as a mechanism underlying the increased rate of schizophrenia seen in DISC1 variant carriers, and provide insights into how DISC1, and potentially DISC1-interacting proteins such as AKT and GSK-3, could be used as novel therapeutic targets for schizophrenia.

1 Introduction

The Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) gene was originally discovered at the breakpoint of a balanced translocation t(1;11) (q42;q14.3) in a Scottish family and later identified in a North American family with high rates of schizophrenia.1–4 Since then, preclinical models have shown that DISC1 mutant animals exhibit behavioural, neurostructural and neurochemical features relevant to schizophrenia, 5,6 although its significance for the human disease has been debated.7–9 DISC1 is described as a scaffold protein with multiple interactors involved in a wide range of cellular processes including neurotransmitter signalling.10,11 In particular, DISC1 is known to interact with several proteins involved in dopamine signalling including fasciculation and elongation protein zeta 1, phosphodiesterase 4D9 and phosphodiesterase 4B, serine/threonine protein kinase Akt and glycogen synthase kinase-3 (GSK-3)12–16 as well as synaptic interactors such as kalirin7 and the Traf2, Nck-interacting kinase,17,18 and the microtubule/ centrosomal proteins pericentriolar material 1 and Bardet–Biedl syndrome protein.19,20 These multiple interactions have highlighted the potential of DISC1 as a therapeutic target.21–23 The neurotransmitter dopamine is widely thought to have a central role in the aetiology of psychotic disorders.24–26 The dopamine hypothesis of schizophrenia was initially based on the findings that the affinity of antipsychotic medications for dopamine receptors is closely related to their clinical potency,27–29 and that drugs that increase dopamine levels provoke psychotic symptoms in healthy people.30,31 Molecular imaging studies since then have shown increased presynaptic dopamine synthesis capacity and release in schizophrenia32–35 and in subjects with prodromal symptoms of schizophrenia.36–39 Alterations in dopamine D1 and D2/3 receptors, tyrosine hydroxylase (TH) levels and baseline synaptic dopamine levels in schizophrenia have also been reported,40,41 although with some inconsistency.42 These findings highlight why dopaminergic dysfunction has a pivotal role in schizophrenia. In view of this, we sought to review the evidence from animal models that DISC1 pathway alterations may impact on dopaminergic function, as it has not been comprehensively synthesised before. The aim of our review was therefore to summarise the impact of DISC1 on TH levels, dopamine transporter (DAT) levels, basal dopamine levels and after amphetamine administration, dopamine D2 receptor-binding potential (BP), dopamine D1 (D1R) and D2 receptor (D2R) levels, and locomotor activity after amphetamine administration for dopamine-related behaviour.43 We selected publications citing data collection in the midbrain, as this is the location of the majority of dopaminergic neuron cell bodies in the brain, and the frontal cortex, hippocampus and striatum as these are the target sites of the main dopaminergic pathways relevant to psychiatric disorders.

MATERIALS AND METHODS

Selection of studies

The entire PubMed database was searched to select publications. Studies were screened based on the terms (‘Disrupted-inSchizophrenia-1’ OR ‘DISC1’) AND (‘dopamine’ OR ‘tyrosine hydroxylase’ OR ‘dopamine receptor’ OR ‘DAT’ OR ‘amphetamine’ OR ‘behavioral alterations’ OR ‘locomotor activity’ OR ‘Positron Emission Tomography’ OR ‘PET’ OR ‘Single Photon Emission Computed Tomography’ OR ‘SPECT’). Only articles meeting the following criteria were included: (1) original studies; (2) English language; (3) peer-review journals; (4) findings reporting TH levels, DAT levels, basal dopamine levels and/or dopamine levels after amphetamine administration, and/or dopamine receptor-binding potential, dopamine receptor levels and/or locomotion after amphetamine administration in a DISC1 model compared with a control group; and (5) in the frontal cortex, striatum, nucleus accumbens, midbrain and/or hippocampus, as these regions are major target sites of dopaminergic projections in the brain and are thought to be involved in the pathophysiology of schizophrenia.44,45 The DISC1 models were selected based on gene mutation in DISC1 or alteration in the quantitative expression of DISC1 protein. Method and results sections of the eligible articles were screened to identify the measures of interest listed above.

Data extraction

The main outcome measures were the differences between the DISC1 models and controls in (1) TH levels; (2) DAT levels; (3) basal dopamine levels; (4) dopamine levels after amphetamine administration; (5) dopamine receptor-binding potential; (6) D1R and D2R levels; and (7) locomotion after amphetamine administration. In addition, the following data were extracted: (8) authors; (9) year of publication; (10) the DISC1 model; (11) samples size; and (12) methods. The data were extracted by TD and checked by SVT. Findings related to the nucleus accumbens and olfactory tubercle were merged as both being part of the ventral striatum.46

مطالعه ارتباط کنترل ژنتیکی بیوسنتز اسید چرب دانه در براسیکا ناپوس در سطح ژنوم

Genome-Wide Association Study of Genetic Control of Seed Fatty Acid Biosynthesis in Brassica napus

چکیده
اسیدهای چرب و ترکیب آنها در دانه ها, ارزش روغن را برای اهداف تغذیه ای یا صنعتی تعیین می کنند و همچنین بر جوانه زنی دانه و نیز ایجاد گیاهچه اثر می گذارند. برای درک بهتر مبانی ژنتیکی بیوسنتز اسیدهای چرب دانه در کلزا (براسیکا ناپوسL.)، ما یک مطالعه مرتبط در سطح ژنوم را با استفاده از 91205 پلیمورفیسم تک نوکلئوتید (SNP) اعمال نمودیم که توسط یک جمعیت آماری نگاشته با ژنوتیپ بدون چربی با وضوح بالا توسط توالی بندی (SkimGBS) مشخص می شود. ما خوشه ای از مکان های هندسی را در کروموزوم A05 مرتبط با اسیدهای چرب دانه اولئیک (روغنی) و Linاولئیک (لینولئیک) شناسایی کردیم. منطقه ژنوم مشخص شده حاوی اورتولگ هایی از ژنهای Arabidopsis thaliana بود که نقش مهم آنها در تنظیم بیوسنتز اسید چرب دانه شناخته شده است, مانند تریستئاز چربی آسیل-ACP B (FATB) و Fatty Acid Desaturase (FAD5) دارد. این رویکرد ما را قادر می سازد تا ژن های کاری بالقوه تنظیم کننده ترکیب اسید چرب در این محصول مهم تولید کننده روغن را شناسایی نماییم و نشان می دهد که این رویکرد می تواند به عنوان یک ابزار قدرتمند برای تشریح صفات پیچیده برای برنامه های بهبود B. napus استفاده شود.

مقدمه
کلزا (براسیکا ناپوسL.) در حال حاضر دومین تولید کننده بزرگ روغن در جهان پس از سویا است (به ترتیب 70.9 و 314.5 میلیون تن، FAO1). سه اسید چرب اصلی (FAها) در روغن کلزا، اسید اولئیک FA تک-اشباع شده و دو اسید لینولئیک FAs چنداشباع شده و اسید لینولینیک هستند (Smooker et al.، 2011). ارزش تغذیه ای بالای روغن B. napus در مقایسه با سایر روغن های گیاهی به میزان بالای اسید اولئیک و همچنین به نسبت بهینه (2:1) FAهای ضروری لینولئیک (امگا 6) و لینولنیک (امگا 3) نسبت داده می شود (Hu و همکاران، 2006). برای مقاصد صنعتی، پایداری حرارتی روغن B. napus با سطح پایین اسید لینولینیک تضمین می شود. درک مبانی ژنتیکی بیوسنتز اسید چرب در کلزا به منظور دستکاری محتوای آن اهمیت زیادی دارد.
فرایند بیوسنتز روغن در گونه های مدل و عضو دقیقاً مرتبط Brasicaceae به خوبی مشخص شده است؛ Arabidopsis thaliana. این فرایند پیچیده از یک عمل هماهنگ ژن های دخیل در بلوغ دانه، متابولیسم انرژی، اسید چرب و مسیرهای بیوسنتز تریاسیل گلیسرول (TAG) استفاده می کند (Baud and Lepiniec، 2010؛ Bates et al.، 2013). سنتز De Novo FAها در داخل پلاستیدهای دانه اتفاق می افتد و تشکیل اسید پالمیتیک (16:0)، اسید استریک (18:0) و اسید اولئیک (18: 1) را میسر می سازد. پس از تولید، آنها توسط دو دسته از آنزیم های تیواستراز ACP-آسیل (FAT) منتشر می شوند: FATA با نسبت بالاتری نسبت به 18:1-ACP و FATB با همبستگی بالاتر به 16:0-ACP (Bonaventure et al.، 2003). FAهای پلاستیدال به ریشه اندوپلاسمی منتقل می شوند (ER) که در آنجا می توانند از طریق FAD2 و FAD3، آنزیم های کلیدی شناخته شده برای تولید FAهای لینولئیک (18:2) و لینولنیک (18: 3) که به صورت غیر اشباع شده تولید می شوند، تحت تغییرات اشباع زدایی قرار گیرند (Okuley et al.، 1994؛ Yang و همکاران، 2012). به موازات مسیر اشباع زدایی، FAها می توانند توسط FAE1 به اسید اروسیک طویل شوند یا برای تولید TAG، یک شکل عمده روغن دانه در گیاهان به گلیسرول استری شوند (James et al.، 1995). اگر چه مسیرهای متابولیک برای سنتز بیوسنتز اسید چرب به خوبی شناخته شده اند، تنظیم ژنتیکی این مسیرها و از این رو ترکیب ترکیبات اسید چرب در دانه، هنوز درک نشده است.
B. napus (AACC، 2n = 38) از هیبریداسیون طبیعی بین B. rapa (AA، 2n = 20) و B. oleracea (CC، 2n = 18) در حدود 7500 سال پیش نشات گرفت. اجداد تضاعف کروموزومی B. napus تحت تکثیر ژنتیکی قرار گرفتند که منجر به تشکیل خانواده های بزرگ ژن و توالی های تکراری افزونه شد. ژن های بیوسنتز روغن در B. napus تحت گسترش قرار گرفته اند که بیش از آن چیزی است که در سایر گیاهان دانه روغنی شناخته شده است (Chalhub et al.، 2014). Polyploidy و پیچیدگی ژنوم B. napus, انتقال محدود دانش پایه از A. thaliana به بهبود محصول کلزا به عنوان شناسایی ژن های فردی کنترل کننده تغییرات طبیعی در این محصول به چالش کشیدن (Wells و همکاران، 2014).
تا به امروز، چندین مطالعه برای تشریح معماری ژنتیکی بیوسنتز اسیدهای چرب در محصولات روغن انجام شده است. مطالعات نگاشت مکان صفت کمی (QTL) در B. rapa (Basnet و همکاران، 2016)، Glycine max (Wang و همکاران، 2014)، Jatropha curcas ، و B. napus, شناسایی جایگاه هایی با اثر آلل کوچک تا بزرگ درگیر در بیوسنتز اسید چرب در دانه ها را میسر ساخت (Burns و همکاران، 2003؛ Hu و همکاران، 2006؛ Zhao و همکاران، 2008؛ Yan و همکاران، 2011؛ Wang و همکاران، 2015). ارتولوگ های کدگذار آنزیم های اصلی دخیل در بیوسنتز FA، مانند FAD2 و FAD3، در B. napus روی کروموزوم های A1، A5، C1، و C5 (Scheffler و همکاران، 1997. Schierholt و همکاران، 2000؛ Yang و همکاران ، 2012) و A3، A4، A5، C3 و C4 (Hu و همکاران، 2006؛ Smooker و همکاران، 2011) نگاشت شده اند. به تازگی، یک رویکرد ژنتیکی سیستم که مطالعات بیان ژن را با نگاشته ژنتیکی QTL (eQTL) ترکیب نمود, منجر به شناسایی دیگر ژن هایFAD (BrFAD5 و BrFAD7) شد که نقشی تعاملی با BrFAD2 در تنظیم FAهای اولئیک و لینولئیک در B. rapa ایفا می کنند (ET Basnet al.، 2016). مطالعات تحلیل رونویسی در توسعه دانه های Arabidopsis و B. napus نشان داد که تنظیم بیوسنتز FA, پیچیده است و شامل ژن های مسئول برای تنظیم رونویسی، سوخت و ساز نشاسته، و همچنین سیگنالینگ هورمون اکسین و جاسمونات (Niu و همکاران، 2009؛ Mendes و همکاران .، 2013؛ Chen و همکاران، 2015).
به تازگی، مطالعات ارتباط در گستره ژنوم (GWAS) به عنوان یک ابزار قدرتمند برای تشریح معماری ژنتیک صفات پیچیده در گونه های محصول (Edwards و همکاران، 2013) تکامل یافته است. پیشرفت ها در توالی بندی نسل بعدی (NGS) امکان شناسایی هزاران مکان نشانگر ژنتیکی را فراهم می کند که ارتباط آماری آنها با صفات مورد نظر را براساس عدم تعادل ارتباط میسر می کند (Davey et al.، 2011). ژنوتیپ مبتنی بر بی چربی بودن با توالی بندی (skimGBS) از توالی ژنوم کلی کم-پوشش (1-10x) برای ژنوتیپ با وضوح بالا استفاده می کند. ژنومیک خوانده شده از افراد والدین به ژنوم مرجع نگاشته می شوند و SNPها پیش بینی می شوند. پس از آن خواندن ها از نسلی به همان مرجع نگاشته می شوند و مقایسه با فایل SNP والدین، باعث فراخوانی SNP ها در نسلی از یک یا چند ژنوتایپ والدین می شود (Bayer et al.، 2015). نشانگرهای وابسته به ژنتیک می تواند به خاطر صفت موردنظر یا در عدم تعادل ارتباط با یک منبع علمی, گاه به گاه باشند (Rafalski، 2010). تا به امروز، رویکردهای GWAS با استفاده از توالی بندی کلی ژنوم به محققان اجازه داده است تا به تشریح مقررات ژنتیکی صفات پیچیده مانند بیوسنتز روغن، غلظت کاروتنوئید و بازده در محصولات به خوبی مورد مطالعه گرفته از جمله ذرت و برنج بپردازند (Gao و همکاران، 2013؛ Li H. همکاران ، 2013؛ Suwarno و همکاران، 2015). در کلزا، GWAS با استفاده از DartSeq و رویکردهای ژنوتیپ آرایه Brassica 60K SNP, شناسایی آلل های درگیر در تنظیم زمان گلدهی، و نیز صفات کیفیت دانه شامل جوانه زنی، قدرت و وزن دانه را میسر نمود (Li و همکاران، 2014؛ Hatzig و همکاران ، 2015؛ Raman و همکاران، 2016).
هدف از مطالعه حاضر، انجام نگاشت ارتباط GWAS با استفاده از SkimGBS ژنوم کلی (Bayer et al.، 2015) برای شناسایی تغییرات آللیمی بود که بر ترکیب اسید چرب در دانه های اولاد از خطوط هیپلوئید دوبل شده 60 B.napus (DH) تاثیر می گذارد. این رویکرد جدید منجر به شناسایی یک کانون ژنومی ژنهای تنظیم کننده کاندیدای کروموزوم A05 از کلزای زمستانی شد.

Fatty acids and their composition in seeds determine oil value for nutritional or industrial purposes and also affect seed germination as well as seedling establishment. To better understand the genetic basis of seed fatty acid biosynthesis in oilseed rape (Brassica napus L.) we applied a genome-wide association study, using 91,205 single nucleotide polymorphisms (SNPs) characterized across a mapping population with high-resolution skim genotyping by sequencing (SkimGBS). We identified a cluster of loci on chromosome A05 associated with oleic and linoleic seed fatty acids. The delineated genomic region contained orthologs of the Arabidopsis thaliana genes known to play a role in regulation of seed fatty acid biosynthesis such as Fatty acyl-ACP thioesterase B (FATB) and Fatty Acid Desaturase (FAD5). This approach allowed us to identify potential functional genes regulating fatty acid composition in this important oil producing crop and demonstrates that this approach can be used as a powerful tool for dissecting complex traits for B. napus improvement programs.

INTRODUCTION

Oilseed rape (Brassica napus L.) is now the second largest oil-producing crop in the world after soybean (70.9 and 314.5 million tons respectively; FAO1 ). Three of the major fatty acids (FAs) in oilseed rape oil are the monounsaturated FA oleic acid and the two polyunsaturated FAs linoleic acid and linolenic acid (Smooker et al., 2011). The high nutritional value of B. napus oil compared to other vegetable oils is attributed to a high level of oleic acid, as well as an optimal ratio (2:1) of the essential linoleic (omega 6) and linolenic (omega 3) FAs (Hu et al., 2006). For industrial purposes, thermal stability of B. napus oil is assured with a low level of linolenic acid. Understanding the genetic basis of fatty acid biosynthesis in oilseed rape is of great importance in order to manipulate its content. The process of oil biosynthesis has been well-characterized in the model species and closely related member of Brasicaceae; Arabidopsis thaliana. This complex process employs a coordinated action of genes involved in seed maturation, energy metabolism, fatty acid, and triacylglycerol (TAG) biosynthesis pathways (Baud and Lepiniec, 2010; Bates et al., 2013). De novo synthesis of FAs occurs within plastids of the seed and enables formation of palmitic acid (16:0), stearic acid (18:0), and oleic acid (18:1). Once produced, they are released by two classes of acyl-ACP thioesterase (FAT) enzymes: FATA with higher affinity to 18:1-ACP and FATB with higher affinity to 16:0- ACP (Bonaventure et al., 2003). Plastidial FAs are transported to the endoplasmic reticulum (ER) where they can undergo desaturation modification via FAD2 and FAD3, key enzymes known to generate polyunsaturated linoleic (18:2) and linolenic (18:3) FAs respectively (Okuley et al., 1994; Yang et al., 2012). In parallel to a desaturation pathway, FAs can be elongated by FAE1 to erucic acid or esterified to glycerol to generate TAG, a major form of seed oil in plants (James et al., 1995). Although the metabolic pathways for fatty acid biosynthesis synthesis are well known, genetic regulation of these pathways, and thus variable fatty acid composition in seed, is still poorly understood. B. napus (AACC, 2n = 38) originated from natural hybridization between B. rapa (AA, 2n = 20) and B. oleracea (CC, 2n = 18) around 7500 years ago. The diploid progenitors of B. napus underwent genetic triplication which led to formation of large gene families and abundant repetitive sequences. Oil biosynthesis genes have undergone expansion in B. napus which exceeds that known in other oilseed plants (Chalhoub et al., 2014). Polyploidy and the genome complexity of B. napus limit translation of fundamental knowledge from A. thaliana into oilseed rape crop improvement as identification of individual genes controlling natural variation in this crop is challenging (Wells et al., 2014). To date, several studies have been undertaken to dissect the genetic architecture of fatty acid biosynthesis in oil crops. Quantitative trait loci (QTL) mapping studies in B. rapa (Basnet et al., 2016), Glycine max (Wang et al., 2014), Jatropha curcas, and B. napus allowed identification of loci with small to large allelic effect involved in fatty acid biosynthesis in seeds (Burns et al., 2003; Hu et al., 2006; Zhao et al., 2008; Yan et al., 2011; Wang et al., 2015). Orthologs encoding major enzymes involved in FA biosynthesis, such as FAD2 and FAD3, have been mapped in B. napus on chromosomes A1, A5, C1, and C5 (Scheffler et al., 1997; Schierholt et al., 2000; Yang et al., 2012) and A3, A4, A5, C3, and C4 (Hu et al., 2006; Smooker et al., 2011) respectively. Recently, a systems genetic approach that combined gene expression studies with QTL genetic mapping (eQTL) led to identification of other FAD genes (BrFAD5 and BrFAD7) playing an interactive role with BrFAD2 in regulation of oleic and linoleic FAs in B. rapa (Basnet et al., 2016). Transcriptional analysis studies in developing seeds of Arabidopsis and B. napus showed that regulation of FA biosynthesis is complex and involves genes responsible for transcriptional regulation, starch metabolism, as well as auxin and jasmonate hormone signaling (Niu et al., 2009; Mendes et al., 2013; Chen et al., 2015). Recently, genome wide association studies (GWAS) have evolved as a powerful tool to dissect the genetic architecture of complex traits in crop species (Edwards et al., 2013). Advances in next generation sequencing (NGS) allow identification of thousands of genetic marker loci which enables their statistical association with traits of interest based on linkage disequilibrium (Davey et al., 2011). Skim-based genotyping by sequencing (skimGBS) uses low-coverage (1–10x) whole genome sequencing for high resolution genotyping. Genomic reads from parental individuals are mapped to the reference genome and SNPs are predicted. Reads from the progeny are then mapped to the same reference and comparison with the parental SNP file enables the calling of SNPs in the progeny of one or other of the parental genotypes (Bayer et al., 2015). Associated genetic markers can be causal for the trait of interest or in linkage disequilibrium with a causal locus (Rafalski, 2010). To date, GWAS approaches using whole genome sequencing have allowed researchers to dissect genetic regulation of complex traits such as oil biosynthesis, carotenoid concentration and yield in well studied crops including maize and rice (Gao et al., 2013; Li H. et al., 2013; Suwarno et al., 2015). In oilseed rape, GWAS using DartSeq and Brassica 60K SNP array genotyping approaches allowed identification of alleles involved in regulation of flowering time, as well as seed quality traits including germination, vigor and seed weight (Li et al., 2014; Hatzig et al., 2015; Raman et al., 2016). The aim of the present study was to perform GWAS association mapping using whole genome SkimGBS (Bayer et al., 2015) to identify allelic variation that affects fatty acid composition in progeny seeds from 60 B. napus doubled haploid (DH) lines. This novel approach led to identification of a genomic hotspot of candidate regulatory genes on chromosome A05 of winter type oilseed rape.

مقاله انگلیسی رایگان (PDF)

ترجمه فارسی رایگان (PDF)

خرید ترجمه با فرمت ورد

بخشی از ترجمه فارسی مقاله:

زمینه
در سال 1863، فریدریش ابتدا یک آتاکسی زودهنگام ارثی مرتبط با کیفواسکلیوزیس و دژنراسیون چربی قلب را در شش عضو از دو خانواده مرتبط با انحطاط ستون های پشتی و ریشه های پشتی توصیف کرد(1). فردریش اختلال را به عنوان نقص رشدی بصل النخاع تفسیر کرد. مشابه بیماری تابس دورسالیس ، او ضایعات ستون فقرات را عمدتا التهابی در نظر گرفت. کار فریدریش در طول عمر او توجه کمتری به خود جلب کرد. تنها 30 سال پس از توصیف اصلی فریدریش، پیر ماری متوجه اثرات علمی کار نیکولاوس فریدریش از طریق افتراق FA از اتاکسی غالب شد. (2).

اپیدمیولوژی

در جوامع غربی، شیوع FA بین 1:20000 و 725000: 1 متغیر است. مطالعات اپیدمیولوژیک نشان دهنده شواهدی از شیب پراکندگی از غرب تا شرق در اروپا با بالاترین سطح در جنوب فرانسه، شمال اسپانیا و ایرلند و پایین ترین سطح در اسکاندیناوی و روسیه است (3). فراوانی حامل بین 1:55 (شمال اسپانیا) و 1: 336 (روسیه) متفاوت است (3). تجزیه و تحلیل کروموزوم هاپلوتایپ Y انسانی به پناهگاه دوره یخبندان فرانسو کانتربری به عنوان منشا جمعیت ناقل FA اشاره می کند (3). FA در جمعیت ایالات متحده آفریقا کم و در شرق دور بسیار نادر است.

فنوتیپ

شروع، پیشرفت و مرگ
FA یک اختلال با سیر پیشروی کند است. معمولا شروع علائم در نوجوانی ( با میانگین سنی 15.5 سال ، 8 SD سال) با بی ثباتی در راه رفتن است (4). بعضی از افراد ابتدا به دنبال کمک پزشکی برای اسکولیوز هستند. یک پنجم از بیماران در ابتدا جوانتر از 5 سال هستند (5). زمان متوسط برای از دست دادن توانایی راه رفتن بطور مستقل، 8 سال است (6). بیماران معمولا پس از یک دوره بیماری متوسط بین 11 تا 15 سال (محدوده 3 تا 44 سال) معمولا به صندلی چرخدار نیاز پیدا می کنند (5). شروع بیماری در سن 20 سالگی و درگیری قلبی با پیشرفت سریع علائم عصبی همراه است (6). جالب توجه است، علائم بالینی با میزان مشابهی پیشرفت نمی کنند. اختلال تکلم در طی 10 تا 15 سال و دیابت طی 16 سال ظاهر می شود در حالیکه از دست دادن حس عمقی بیش از 40 سال طول می کشد. امید به زندگی در طول سال های اخیر به طور قابل توجهی بهبود یافته است. علل اصلی مرگ و میر عبارتند از: پنومونی آسپیراسیون، عوارض قلبی (60٪)، کمای دیابتی، سکته مغزی و عوارض تروما (6و7) . وجود دیابت و / یا اتساع كاردیومیوپاتی بر روی بقا اثر منفی دارد. در کل، پیش آگهی در زنان بهتر است (8).
فنوتیپ های غیر معمول
با شناسایی پس زمینه ژنتیکی [9]، اشکال غیر عادی FA قابل شناسایی شدند. سپس مشخص شد که فقط 75٪ بیماران می توانند به درستی به عنوان موارد FA براساس معیارهای اولیه هاردینگ [4، 10] تشخیص داده شوند. در بروز دیر رس FA (LOFA، بروز بعد از 25 سال) و یا شروع بسیار دیر FA (VLOFA، شروع بعد از 40 سال) پیشرفت کندتر است. علائم غیر عصبی مانند بیماری های قلبی عروقی، دیابت و یا تغییر شکل های اسکلتی کمتر شایع است. فنوتیپ اغلب تشنجی با کمی آتاکسی و یا بدون آن است. بنابراین، FA را باید در کار تشخیصی در نظر گرفت حتی در افراد مبتلا به پس از 60 سال و عدم وجود ویژگی های مشخص.

بخشی از مقاله انگلیسی:

Background

In 1863, Friedreich first described an inherited early onset ataxia associated with kyphoscoliosis and fatty degeneration of the heart in six members from two families associated with degeneration of the dorsal columns and dorsal roots [1]. Friedreich interpreted the disorder as a developmental defect of the medulla oblongata. In analogy to tabes dorsalis, he considered the spinal lesions as mainly inflammatory. Friedreich’s work gained little attention during his lifetime. Only 30 years after Friedreich’s original description, Pierre Marie realized the scientific impact of Nikolaus Friedreich’s work by discriminating FA from dominant ataxias [2].

Epidemiology

In Western populations, the prevalence of FA varies between 1:20 000 and 1:725 000. Epidemiological studies gave evidence of a west to east prevalence gradient in Europe with highest levels in the South of France, North of Spain and Ireland and lowest levels in Scandinavia and Russia [3]. Carrier frequencies vary between 1:55 (North Spain) and 1:336 (Russia) [3]. Human Y chromosome haplotype analyses point to a Franco-Cantabrian ice age refuge origin of the FA carrying population [3]. FA is rare in sub-Saharan African populations and very rare in the Far East.

Phenotype

Onset, progression, and death

FA is a slowly progressive disorder. Usually, the onset of symptoms is during adolescence (mean 15.5 years, SD 8 years) with unsteadiness of gait [4]. Some individuals first seek medical help for scoliosis. One fifth of patients is younger than 5 years at onset [5]. Mean time to loss of independent gait is 8 years [6]. Patients usually become wheelchair bound after a mean disease duration of 11–15 years (range 3 to 44 years) [5]. Disease onset before the age of 20 and cardiac involvement are associated with faster progression of neurological symptoms [6]. Interestingly, clinical symptoms do not progress at the same rate. Dysarthria manifests within 10 to 15 years and diabetes within 16 years whereas loss of proprioception takes more than 40 years to develop. Life expectancy has improved considerably during the last years. Typical causes of death are aspiration pneumonia, cardiac complications (60%), diabetic coma, stroke and trauma sequelae [6, 7]. The presence of diabetes and/or dilated cardiomyopathy has a negative impact on survival. Overall, prognosis seems better in females [8].

Atypical phenotypes

With the identification of the genetic background [9], atypical forms of FA became identifiable. It then became evident that only 75% of patients could be diagnosed correctly as FA cases based on the original Harding criteria [4, 10]. Late onset FA (LOFA, onset after 25 years) or very late onset FA (VLOFA, onset after 40 years) have a slower progression. Non-neurological symptoms such as cardiomyopathy, diabetes, or skeletal deformities are less frequent. The phenotype is often more spastic with little or no ataxia. Therefore, FA should be considered in the diagnostic work-up even in individuals with onset after 60 years and absence of characteristic features.

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

آنالیز بقای DEGs
Kaplan–Meier plotter قادر است که اثر 54675ژن بر بقا را با استفاده از 10188نمونه سرطان بیماران شامل 4142 سرطان سینه، 1648 سرطان تخمدان، 2437 سرطان شش و 1065 سرطان معده ارزیابی کند. بیماران با سرطان تخمدان به دو گروه بر اساس بیان یک ژن خاص تقسیم میشوند. بقای کلی بیماران با سرطان تخمدان با استفاده از طرح Kaplan–Meier آنالیز شد. نسبت خطر HR با 95% فاصله ی اطمینان و مقدار درجه P محاسبه شده و در صفحه ی وب نمایش داده شده است.

نتایج
شناسایی DEGs
مجموعه ی DEGs 1330، 4944 و 2610 از مجموعه اطلاعات GSE36668، GSE18520 و GSE14407 به ترتیب شناسایی شد. 362 ژن در هر سه این مجموعه اطلاعات نمایش داد هشده است (شکل1) از بین آنها 345 ژن گرایش بیان ژنی مشابه در هر سه مجموعه اطلاعات نشان دادند شامل 168 ژن تنظیم شده در بالادست و 177 ژن تنظیم شده در پایین دست در بافت های سرطان تخمدان با بافتهای تخمدان نرمال مقایسه شدند.

آنالیز عملکردی و غنای مسیر
برای به دست آوردن بینش بیشتر از عملکرد DEGs های شناسایی شده آنالیز عملکردی و غنای مسیر با استفاده از DAVID اجرا شده است. ژن های تنظیم شده در بالادست عمدتا در فرآیند زیستی مرتبط با سیکل سلولی و میتوز درگیر میشوند در حالیکه ژن های تنظیم شده در پایین دست عمدتا در تمایز جنسی، فرآیند سیکل تخمک گذاری، پاسخ به محرک های هورمون و تکامل ساختار دخیل هستند. (جدول 1) به علاوه، هفت مسیر KEGG در ژن های پایین دست شامل سیکل سلولی ، میوز اووسیت و مسیر علامت دهی P53 بیش از حد بیان میشود جدول 1. هیچ مسیر KEGGبه طور قابل توجه برای ژن های تنظیم شده در پایین دست نبود.

ساخت شبکه PPI و انتخاب واحدها
شبکه PPI DEGs شامل 141 گره و 296 لبه ، شامل 86 ژن تنظیمی بالادست و 55 ژن تنظیمی پایین دست است شکل2a. درجه بزرگتر ومساوی 10 تنظیم شد به عنوان معیار. مجموع 16 ژن به عنوان ژن های قطب شامل CDK1، AURKB، CCNB1 و CDC20 استانتخاب شده اند. علاوه بر آن، مشخص شد که cyclin B1 (CCNB1) برهمکنش با عضو 11 خانواده ی کینسین KIF11 و پروتئین سانترومر F دارد CENPF.
یک واحدقابل توجه از شبکه ی PPI DEGs با استفاده از MCODE شامل 12 گره و 66 لبه فراهم شده است. شکل 2b. آنالیز عملکردی و غنای مسیر KEGG فاش کرد که ژن ها در این واحد عمدتا با سیکل سلولی و میتوز اووسیت مرتبط هستند. (جدول 2).

جفت های miRNA-DEG
همه 36 miRNA بیان شده از مجموعه اطلاعات GSE47841 نمایش داده شده اند شامل 15 miRNA تنظیمی بالادست و 21 miRNA تنظیمی پایین دست در سرطان تخمدان با نمونه نرمال تخمدان مقایسه شده اند. همانطور که در جدول 3 نشان داده شده miR-200a ،بیشترین miRNAتنظیمی بالادست قابل توجه بود در حالیکه miR-424 بیشترین، miRNAتنظیمی پایین دست بود. بر اساس مجموعه اطلاعات miRecords، هدف های پیشگویی شده miRNA فراهم شدند. با مقایسه ی هدف ها با DEGs ما دریافتیم که CD47 هدف بالقوه هشت miRNAشامل موارد زیر بود. has-miR-182, has-miR-141, has-miR-200c, hasmiR-183, has-miR-424, has-miR-381, has-miR-383, has-miR-542-5p به علاوه KIF11 به طور بالقوه توسط has-miR-424 و has-miR-381 مورد هدف قرار گرفت که با تمایل بیانشان در سرطان تخمدان ثابت بودند.
Kaplan–Meier plotter
مقدار پیش آگهی ژن های قطبی در شبکه PPI در www.kmplot.com ارزیابی شد. بقای سرتاسری برای بیماران با سرطان تخمدان بر اساس بیان کم یا زیاد هر ژن فراهم شده است. مشخص شد که بیان mRNA CCNB1 با بقای سرتاسری برای بیماران سرطان تخمدان ارتباط دارد همین طور CENPF ، KIF11 و ZWINT. شکل 3.

بحث
با وجود پیشرفت در درمان های جراحی و پزشکی، مرگ کلی سرطان تخمدان به طور گسترده بدون تغییر در طول دهه گذشته باقی مانده است. مرگباری سرطان تخمدان عمدتا به علت مشکل بودن کاوش کردن آن در مرحله ی اولیه و نقصان درمان های موثر برای بیماران در شرایط پیشرفته است. بنابراین، درک عوامل و مکانیسم های پیشرفت سرطان تخمدان برای بهبود نرخ بقا و جلوگیری ضروری است. اخیرا، تکنولوژی میکرواری به سرعت پیشرفت کرده است و به گستردگی برای آشکار کردن تغییر ژنتیکی عمومی در پیشرفت بیماری ها به کار میرود که شناسای هدف های بیماری ، درمان و پیش بینی تومور قادر میسازد.
در این مطالعه، مجموعه 345 DEGs نمایش داده شد که شامل 168 ژن تنظیمی بالادست و 177 ژن تنظیمی پایین دست است. این ژن های بالا دست عمدتا در سیکل سلولی ، میتوز و مسیر علامت دهی P53 وجود دارند که به نزدیکی با سرطان ارتباط دارد درحالیکه ژن های تنظیمی پایین دست در سیکل تخمک گذاری و تمایز جنسی اثر دارند. از بین این DEGs ها ، 16 ژن درجه بالایی در شبکه ی PPI دارند. آنالیز بقا این ژن ها آشکار کرد که چهار ژن تنظیمی بالا دست به طور قابل توجهی با بقای کلی بیماران با سرطان تخمدان ارتباط دارد شامل CCNB1, CENPF, KIF11, ZWINT.
بیماری زایی تومور یک فرآیند پیچیده است که از تغییرات اپی ژنتیک و ژنتیک خاص مشتق شده است. افزایش بیان CCNB1 در بسیاری از بیماری های مختلف شامل سرطان روده بزرگ، سرطان پانکراس، و ملانوم یافت شده است. CCNB1 میتواند کیناز وابسته به سیکل CDK1 را فعال کند که کلید وقایع اولیه میتوز را توسط آغاز فسفریلاسیون پروتئین های مختلف در G2/M را کنترل میکند. بیان کم CCNB1 می تواند تکثیر را سرکوب کند و آپوپتزیز (مرگ سلولی) را در سرطان تخمدان القا کند. CENPF در کروموزوم 1q41 پروتیئنی را کد میکند که با کمپلکس سنترومر –کینتوکور ارتباط دارد. گزارش شده است که CENPF دارای دو زیرواحد اتصال میکروتوبول است بنابراین نقشی در انصال میکروتوبول و حرکت میکروتوبول در طول میتوز ایفا میکند. جمع اوری شواهد نشان داد که بیش از حد بیان شدن CENPF در نوعی سرطان های چندگانه شامل سرطان سینه، hepatocellular carcinoma درگیر است. Yang و همکاران دریافتند که بیان افزایش یافته CENPF با پیش آگهی ضعیف در بیماران با سرطان پروستات ارتباط دارد. اگرچه، نقش سرطانی و بالینی مهم CENPF برای سرطان تخمدان به ندرت مطالعه شده است. در مطالعه ی حاضر ، ما دریافتیم که CCNB1 و CENPF بیش از حد بیان شده اند و برهمکنش دارند که نشان دهنده ی عملکرد اتصال در سرطان تخمدان است.
یکی از اعضای خانواده پروتئین شبه-کینسین KIF11 ، پروتئین حرکت دوک بحرانی در طول استقرار دوقطبی دوک میتوزی است. گزارش شده است که ممانعت KIF11 با با مولکول های کوچک بازدارنده می تواند پیشرفت سیکل سلولی را ممانعت کند، موجب جدایی غیر نرمال کروموزوم ها شود و نهایتا منجر به مرگ سلولی در سلول سرطانی سر و گردن سنگفرشی میشود. نتایج مشابه هم نشان داد که بازدارندگی KIF11، تکثیر و حمله در گلیوبلاستوما را سرکوب میکند که پتانسیل آن را به عنوانیک ضد سرطان نشان میدهد. در همین حال، جهش یافته ها در KIF11 ، یک دلیل رایج تنوع بیماری های مسری از قبیل سندرم میکروسفالی و chorioretinal dysplasia بودند. سرهم شدن کینوتوکور یک مرحله ی کلیدی در پیشرفت سیکل سلولی است. ZWINT به عنوان یک بخش از کمپلکس کینتوکور ، یک پروتئین است که با ZW10 که برای تحرک کروموزوم و نقطه ی چک کردن دوک میتوزی ضروری است؛ برهم کنش میدهد. Endo و همکاران دریافتند که رشد سلول ها توسط بیان ثابت ZWINT افزایش می یابد در حالیکه این توسط هدف گذاری ZWINT با siRNA در سلول های سرطان سینه MCF7 سرکوب شده است. در مجموع این اطلاعات پیشنهاد میکند که CCNB1 ، CENPF، KIF11 و ZWINT در بیماری زایی تومور بدخیم توسط اثرگذاری بر میتوز و فرآیند سیکل سلولی درگیر است که یافته های ما را تایید میکند.

توالی یابی به روش پایرو سکیوانسینگ ترانسکریپت روده سوسکچه های خرطوم دار موز حاکی از رونوشت های شبه پروتئاز چندگانه است

Pyrosequencing the Midgut Transcriptome of the Banana Weevil Cosmopolites sordidus (Germar) (Coleoptera: Curculionidae) Reveals Multiple Protease-Like Transcripts

Abstract

The banana weevil Cosmopolites sordidus is an important and serious insect pest in most banana and plantain-growing areas of the world. In spite of the economic importance of this insect pest very little genomic and transcriptomic information exists for this species. In the present study, we characterized the midgut transcriptome of C. sordidus using massive 454-pyrosequencing. We generated over 590,000 sequencing reads that assembled into 30,840 contigs with more than 400 bp, representing a significant expansion of existing sequences available for this insect pest. Among them, 16,427 contigs contained one or more GO terms. In addition, 15,263 contigs were assigned an EC number. In-depth transcriptome analysis identified genes potentially involved in insecticide resistance, peritrophic membrane biosynthesis, immunity-related function and defense against pathogens, and Bacillus thuringiensis toxins binding proteins as well as multiple enzymes involved with protein digestion. This transcriptome will provide a valuable resource for understanding larval physiology and for identifying novel target sites and management approaches for this important insect pest

1 Introduction

The banana weevil Cosmopolites sordidus (Germar) (Coleoptera: Curculionidae) is considered one of the most invasive and destructive pests of banana worldwide [1]. The larvae of C. sordidus are a severe constraint on banana and plantain production in most areas where these crops are cultivated, especially in Africa [2–5] where this insect pest has been associated with rapid plantation decline [6] and with a phenomenon called “yield decline syndrome” in West Africa. The larvae of the banana weevil, which are the most destructive stage of the insect, is responsible for considerable damage of the plant corm, interfering with root initiation, nutrient and water uptake and plant development [6]. When a severe weevil infestation occurs, crop losses of up to 100% have been reported [7]. It is well known that chemical control of this insect pest is not only undesirable but also expensive. Options for biological control are limited and pheromone-based insect trapping results in either low or ineffective captures [8, 9]. Many basic advances have been made by studying the banana weevil, including, studies regarding pest resistance [10], insect resistant germplasm [2, 11, 12], plant antifeedants [13], cultural control practices [14] and biological control [15]. Despite extensive and recent biochemical and physiological studies, limited genomic information exists, especially for important tissues such as the midgut. The availability of transcriptome sequences from insect midgut tissues will facilitate identification of genes that are expressed in the intestinal tract and their respective metabolic and functional roles. It is well known that the curculionids are the largest family of beetles [16], which in general are important plant tissue damaging pests such as the banana weevil C. sordidus[1]. The rapid growth of next-generation DNA sequencing technologies such as 454-based pyrosequencing [17, 18] have allowed the characterization of the transcriptome of many important, non-model insect species [19–23], thus providing valuable and unprecedented opportunities to increase our knowledge of expressed genes, especially in those insect pests where little or no genomic resources exist [24]. In this study, we used a 454-based pyrosequencing platform to sequence the C. sordidus larval midgut transcriptome allowing the characterization of transcripts encoding different genes associated with metabolic functions and potential insecticide targets. Many of these transcripts were protease-like genes from different digestive enzyme families, mainly associated with aminopeptidases, carboxypeptidases, serine proteases and cysteine proteases. The C. sordidus transcriptome represents an important contribution to understanding the biology of this insect pest and for the identification of potential target genes involved in protein digestion and many other metabolic pathways.

Materials and Methods

The experiments were carried out under a standard protocol in the lab and no specific permissions were required for these locations/activities. In addition, these study did not involve any endangered or protected species.

Insect dissection and of midgut RNA extraction

C. sordidus larvae were collected from corms obtained at a plantain field near Manizales, Colombia (1058 m, 5° 4’ 13.2” N, 75° 41’ 7.7” O). Collected larvae were inspected under a stereoscope and the fourth instar larvae were selected based on the size of the head capsule as described by [25] and then used for midgut dissection (Fig 1). Gut tissue was obtained by dissecting in DEPC-treated distilled water. The gut content and peritrophic matrix were removed and the washed midgut tissue was flash-frozen using liquid nitrogen and stored at -80°C. RNA extraction was performed using TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) following the manufacturer’s instructions. RNA was then purified using the RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) after removing genomic DNA contamination using the TURBO DNA-free™ Kit (Ambion, Carlsbad, CA) according to manufacturer’s instructions.