مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب)

F1826

نوکلئاز انگشت روی (ZFN) به سرعت تبدیل به ابزار کارآمد برای ویرایش ژن شد که برای ایجاد پستانداران ترانسژن استفاده شد. همانطور که قبلا ذکر شد، اولین مورد از این گزارشات، در مورد تولید رت های knockout (Geurts و همکاران، ۲۰۰۹) بود. رت ها گونه های پستاندارانی هستند که در آن روش رویکرد کلاسیک هدف قرار دادن ژن به علت عدم وجود سلول های معادل ES رت امکان پذیر نبود. در واقع، سلول های ES رت چند ماه قبل از انتشار مطالعه رت knockout جدا شده بودند (Buehr و همکاران ۲۰۰۸). استفاده از ZFN برای تولید پستانداران ترانس ژنیک به سرعت در میان آزمایشگاه های متعدد منتشر شد (Remy و همکاران، ۲۰۱۰) و به زودی نشان داده شد که ZFN در آزمایشات ویرایش ژنوم در موش (Carbery و همکاران، ۲۰۱۰؛ Meyer و همکاران، ۲۰۱۰)، احشام ( یو و همکاران، ۲۰۱۱؛ لیو و همکاران ۲۰۱۳؛ Wei و همکاران، ۲۰۱۵) و خوک ها (Hauschild و همکاران، ۲۰۱۱؛ Carlson و همکاران، ۲۰۱۲؛ Kwon و همکاران ۲۰۱۳؛ چیان و همکاران ۲۰۱۵) با موفقیت همراه بوده است .
بزرگترین تأثیر ZFN احتمالا در گونه های دام بود، زیرا عدم وجود سلول های ES واجد شرایط خاص گونه، تغییرات ژنومی را که نیازمند رویدادهای HR بود را محدود می کرد (Petersen and Niemann 2015). نمونه های خوبی از ZFN برای برنامه های کاربردی دام، با گاوهای اصلاح شده ژنومی با افزایش مقاومت به ماستیت(التهاب پستان) نشان داده شده است (لیو و همکاران، ۲۰۱۴a، b) و یا خوک های اهلی که ژنوم آنها ویرایش شده و حامل یک واریانت ژن RELA مشتق از گراز با هدف انتقال خاصیت بهبودی مرتبط با تب خوک آفریقایی (Lillico et al 2016) هستند.
برنامه های کاربردی ژن درمانی با ZFN همچنین در کشت بافت (مثلا Overlack و همکاران ۲۰۱۲) بکار برده شدند و مورد بررسی قرار گرفتند . این برنامه ها شامل انتقال ساختارهای بیانی برای این نوکلئازهای کایمریک از طریق ذرات مرتبط با ویروس آدنو( (AAV بود (Ellis et al. 2013). به موازات همین، با این حال، برخی از پیامدهای ناخواسته کشف شد. به عنوان مثال، مشاهده شد که اختصاصیت توالی ZFN دقیق نیست و توالی های ژنومی مشابه (که off-targets نامیده می شود) نیز می تواند مورد هدف قرار گیرند و در نهایت با مولکول DNA اهدا کننده ترمیم شود،که این یکی از محدودیت های فعلی نوکلئاز ویرایش ژنوم را برجسته می کند (Radecke و غیره ۲۰۱۰). با این وجود، برخی از مطالعات پری کلینیک استفاده کننده از ZFN در سلول های انسانی تا مرحله آزمایشات بالینی پیشرفت کرده اند؛ همانطور که این مسئله با غیر فعال شدن CCR5 که کو رسپتور اچ آی وی است نشان داده است و توسط مقامات نظارتی ایالات متحده تصویب شده است (Maier et al 2013، Tebas et al.، ۲۰۱۴) .
به عنوان یک نکته نهایی برای این بخش، مشخص شد که متدولوژی ZFN برای آزمایشگاه های زیست شناسی استاندارد به راحتی قابل دسترس نیست و همچنین مقرون به صرفه نیست و این واقعیت ممکن است موفقیت و تاثیر ZFN را در ترانسژنزیس پستانداران محدود کند. در واقع، اگر چه برخی از پلتفرم ها باز برای تولید ZFN (Hermann و همکاران، ۲۰۱۲) ایجاد شد، اکثر آنها توسط شرکت هایی که دارای حق ثبت اختراع برای این فناوری بودند، تجاری شدند (Swarthout و همکاران، ۲۰۱۱).
افکتور نوکلئاز شبه فعال کننده رونویسی (TALEN)
در سال ۲۰۱۱، نوع جدیدی از نوکلئاز ویرایش کننده ژنوم ، که به عنوان افکتور نوکلئاز شبه فعال کننده رونویسی( (TALEN شناخته می شود، در این زمینه گزارش شده است، که نشان دهنده یک جایگزین بالقوه برای ZFN است. مشابه آنچه که برای ZFN ذکر شد، TALEN اولین بار برای تولید موش های knockout ، استفاده شد (Tesson et al.، ۲۰۱۱). با وجود اینکه برای هدفگیری ژن در موش ها از سال ۱۹۸۷ پرتکل استاندارد تعریف شد، ویرایش دقیق ژنوم در رت دهه ها امکان پذیر نبود و این مسئله به احتمال زیاد توضیح می دهد که چرا این فن آوری های جدید برای اولین بار در رت استفاده شد و در نهایت به موش منتقل شد. در واقع، به زودی پس از آن، استفاده از TALEN برای ویرایش ژنوم در موشها گسترش یافت، بطوری که تعداد زیادی از مدل های جدیدی knockout به سرعت ایجاد شد (Panda et al. 2013؛ Sung et al. 2013؛ Wang et al. 2013a؛ Wefers et al. 2013) . TALEN نیز برای تولید گونه های حیوانی که ژنوم آنها ویرایش شده (Carlson et al. 2012)، از جمله خوک ها (Xin et al. 2013)، بز (Cui و همکاران، ۲۰۱۵)، گوسفند و گاو (Proudfoot et al. 2015؛ Wei و همکاران ۲۰۱۵) و پریمت های غیر انسانی (Liu et al 2014a، b) استفاده شد. باز هم همانند آنچه که برای ZFN مشاهده شد، TALEN به عنوان ابزار قوی و قابل اعتماد برای چندین کاربرد بیوتکنولوژی و زیست پزشکی در دام ها شناخته شده است و به ویژه به عنوان یک استراتژی کارآمد برای تولید مدل های بزرگ حیوانات از بیماری های انسانی به کار گرفته شده است(Whitelaw et al 2016 ). برنامه های کاربردی کشاورزی با استفاده از TALEN شامل تولید گاوهای اصلاح شده ژنومی بدون شاخ ، مطابق با یک آلل جهش یافته طبیعی (Tan و همکاران ۲۰۱۳) و یا تولید گاو اصلاح شده ژنومی با افزایش مقاومت به سل است (Wu et al. 2015).
در حالی که TALEN دارای شباهت هایی با ZFN است، برخی تفاوت های جذاب نیز وجود دارد. هر دو ZFN و TALEN پروتئین های کایمریکی هستند که بوسیله اتصال یک DNA-binding domain با دمین اندونوکلئاز مشابه ، از رستریکشن آنزیم FokI ایجاد شده اند. آنها همچنین به عنوان دایمر عمل می کنند، بدین ترتیب یک جفت از ZFN یا TALEN همیشه باید در نظر گرفته شود تا مکان ژنومی مورد نظر را هدف قرار داهند. این به طور معمول از طریق الگوریتم های مبتنی بر وب به دست می آید که به محققان کمک می کند تا بهترین توالی های DNA هدف را در هر دو رشته در لوکوس هدف پیدا کنند. (Periwal 2016). با این حال، در حالی که ZFN به طور کامل در آزمایشگاه ، با اختصاصیت اتصال به DNA مشخص، بر اساس یک کد احتمالی که گروه های سه اسید آمینه ای را با سه نوکلئوتید لینک می کند، مهندسی شده است ؛ TALEN حاصل از پروتئین TALE است که در طبیعت وجود دارد و توسط برخی از پاتوژن های آلوده کننده گیاهی استفاده می شود تا آنها بتوانند دستگاه های سلولی را برای حمایت از چرخه زندگی پاتوژن به کار گیرند (موسولینیو و کاتومان ۲۰۱۲). از طریق بررسی سیستماتیک پروتئین های متعدد TALE، رمزگشایی یک کد مرتبط با دو آمینو اسید دقیق موجود در درون پروتئین با ظرفیت آن برای اتصال به یک نوکلئوتید مشخص، امکان پذیر بود (Bochtler 2012). بر خلاف ZFN، که به یک شرکت اختصاص داده شده بود و باید از طریق آن سفارش داده می شد، تولید TALEN مهندسی شده بصورت لوکال راحت بود. در واقع هر آزمایشگاه بیولوژی مولکولی می تواند به راحتی یک مجموعه بزرگ از عوامل واسطه ای را که به صورت پلاسمید در دسترس هستند، خریداری کند، که می تواند برای تولید TALEN سفارشی با استفاده از پروتکل کلونینگ گام به گام گلدن گیت بر اساس کاربرد ابتکاری از آنزیم های محدود الاثر نوع II برای سرهم بندی قطعات DNA مورد استفاده قرار گیرد ( DNA Cermak et al 2015، Sakuma و Yamamoto 2016). از لحاظ تئوری، کیت مونتاژ گلدن گیت و پروتکل آن، امکان طراحی و تولید آسان هر TALEN ای را مطابق با توالی DNA هدف فراهم می کند. در واقع، با این وجود، این فرایند می تواند طولانی و پر زحمت باشد زیرا پلاسمید های متعددی برای تولید یکی از این نوکلئازهای مهندسی شده مورد نیاز است. علاوه بر این، اینکه آیا TALEN نهایی، در نهایت می تواند توالی DNA مورد نظر را مورد هدف قرار دهد و آنرا برش دهد یا خیر ، متاسفانه غیر قابل پیش بینی باقی می ماند و تنها با تایید هر TALEN جدید تولید شده در آزمایشگاه و in vivo ( (Seruggia and Montoliu 2014) حل و فصل می شود.
افکتور نوکلئاز شبه فعال کننده رونویسی (TALEN) همچنین برای برنامه های ژن درمانی کاربرد دارد که در آن تعدادی از راهبردهای پری کلینیکال، از جمله سلول های بنیادی پرتوان انسانی القا شده (iPSC)، با موفقیت مورد بررسی قرار گرفته اند (به عنوان مثال Osborn et al. 2013؛ Ramalingam et al. 2014؛ Biffi 2015؛ Garate et al. 2015).
در زمینه ژنتیک موش، TALEN به عنوان یک ابزار ویرایش ژنوم امکان کاربردهای بزرگی را فراهم کرده است . بعنوان مثال یک مطالعه با هدف اصلاح جهش موثر بر عملکرد شبکیه ای که در ارتباط با موش های C57BL / 6N دیده می شود، انجام شد .این نوع موش ها یکی از شایع ترین گونه های موشی inbred هستند که در حال حاضر توسط کنسرسیوم بین المللی فنوتایپینگ موش مورد استفاده قرار می گیرد (IMPC؛ http: //www.mousefhenotype. org). این جهش غیر منتظره می تواند تفسیر فنوتیپ چشم موتاسیون های موشی اضافی تولید شده در پس زمینه ژنتیکی مشابه را مختل کند (Mattapallil et al.، ۲۰۱۲). محققان از TALEN برای اصلاح جهش های اختصاصی C57BL / 6 N در لوکوس Crb1 (آلل جهش یافته rd8) استفاده کردند و موشهای C57BL / 6N با ژنوم ویرایش شده بدون دژنراسیون شبکیه را تولید کردند (Low et al.، ۲۰۱۴).

تناوب‌هایِ کوتاهِ پالیندرومِ فاصله‌دارِ منظمِ خوشه‌ای( کریسپر) و پروتئین های مرتبط با کریسپر (Cas)
در سال ۲۰۱۳، جامعه علمی یک ابزار جدید ویرایش ژنوم با توانایی قابل ملاحظه ای برای ایجاد تغییرات ژنومی دقیق با راندمان بالا را کشف کرد و این سیستم در عین حال در هر آزمایشگاه بیولوژی مولکولی بسیار کاربردی بود. این تکنولوژی مخرب در سال ۲۰۱۲ توسط حداقل دو گروه مختلف (Jinek و همکاران ۲۰۱۲؛ Gasiunas و همکاران ۲۰۱۲) پیش بینی شده بود، اما تا سال ۲۰۱۳، زمانی که ظرفیت آن به عنوان یک ابزار قدرتمند ویرایش ژنوم قابل اثبات بود، خیلی مورد توجه نبود. تناوب‌هایِ کوتاهِ پالیندرومِ فاصله‌دارِ منظمِ خوشه‌ای( کریسپر) و پروتئین های مرتبط با کریسپر (Cas) اجزای یک سیستم ایمنی اکتسابی هستند که بیش از دو دهه پیش در پروکاریوتها کشف و بررسی شده است (Mojica and Montoliu 2016). سیستم CRISPR-CAS و یا ساده تر ابزار CRISPR، اولین بار برای آزمایش ژنوم در سلول های پستانداران در کشت مورد بررسی و استفاده قرار گرفت (Cong و همکاران ۲۰۱۳؛ مال و همکاران ۲۰۱۳) و کمی بعد از آن در موش مورد بررسی قرار گرفت (Wang et al. 2013b) . بلافاصله مشخص شد که این ابزار ویرایش ژنوم نسل سوم ساده ترین، قوی ترین و کارآمدتر از هر چهار روش نوکلئاز گزارش شده، یعنی meganucleases، ZFN، TALEN و CRISPR خواهد بود.
ابزار CRISPR از یک سیستم دفاعی اکتسابی که در بسیاری از آرکی ها و باکتری یافت می شود، مشتق شده است. به طور خلاصه، سیستم CRISPR نیاز به دو جزء اساسی دارد: یک مولکول کوچک RNA، که مسئول جفت شدن با توالی همولوگ DNA در سایت هدف است و یک Endonuclease DNA ، که DNA را برش می دهد و DSB منحصر به فرد را در محدوده انتخابی که توسط مولکول کوتاه RNA هدایت می شود، را تولید می کند. مولكول RNA کوچک ذکر شده در واقع معادل مولكول اصلی RNA كه توسط پروكاریوتها مورد استفاده قرار می گیرد یعنی crRNA و tracrRNA است و این RNA ها به ترتیب مسئول جفت شدن با توالی هدف و تعامل با Cas endonuclease هستند. دو مولکول کوچک RNA به صورت سنتتیک برای ایجاد یک RNA راهنما (sgRNA) و یا به اختصار gRNA توسط آزمایشگاههای جنیفر دوند و امانوئل چارپینتر در مقاله آنها در سال ۲۰۱۲ با هم ادغام شدند ، به این ترتیب این سیستم را که قبلا خودش نسبتا ساده بود، ساده تر می کند (Jinek et al.، ۲۰۱۲). شایع ترین ابزار CRISPR از سیستم CRISPR-CAS موجود در Streptococcus pyogenes مشتق شده است ، که در آن Cas endonuclease مربوطه، Cas9 است . به همین دلیل، ابزار CRISPR اغلب به عنوان CRISPR-Cas9 گزارش می شود. با این حال، از آنجایی که در حال حاضر ما می دانیم که انواع مختلفی از سیستم CRISPR در پروکاریوت ها وجود دارد، هر یک از آنها با مجموعه ای متفاوت از پروتئین های Cas (Makarova و همکاران ۲۰۱۵) همراه است، توصیه می شود به این ابزار ها به عنوان CRISPR-CAS یا حتی سادهتر، ابزارهای CRISPR اشاره شود (Mojica و Montoliu 2016).