دانلود رایگان ترجمه مقاله تکنیک میکرونوکلئوس در در شرایط آزمایشگاهی (نشریه الزویر ۲۰۰۰) (ترجمه رایگان – برنزی ⭐️)

تکنیک میکرونوکلئوس در در شرایط آزمایشگاهی

The in vitro micronucleus technique

چکیده
۱) مقدمه
۱-۱ روش استاندارد شمارش میکرونوکلئی در سلول های متوقف شده در مرحله سیتوکیناز مربوط به لنفوسیت های انسانی ایزوله شده
۱-۲ بررسی لام ها و شمارش تعداد MN
۱-۳ معیاری برای انتخاب سلول های دو هسته ای که از نظر تعداد میکرونوکلئوس رتبه بندی می شوند-
۱-۴ معیاری برای محاسبه میکرونوکلئی
۱-۵ معیاری برای محاسبه پل های نوکلئوپلاسمیک
۱-۶ معیاری برای محاسبه سلول های آپوپتوتیک و‌نکروتیک
۱-۷ شاخص تقسیم هسته ای (NDI) و شاخص سیتوتوکسیتی تقسیم هسته ای (NDCI)
۱-۸ ارزیابی آسیب های مربوط به DNA برشی ترمیم یافته در لنفوسیت های انسانی G0/G1 با استفاده از روش شمارش میکرونوکلئوس سیتوزین آرابینوزید در لنفوسیت های انسانی-
۱-۹ روش CBMN در سایر سیستم های کشت سلولی
۱-۱۰ روش شمارش میکرونوکلئی در لاین های سلولی با مهار سیتوکینز یا بدون توقف سیتوکینز
۲) روش های مولکولی برای ارزیابی از دست رفتن کروموزوم در میکرونوکلئی و کاستمان
۲-۱ شناسایی کینه توکور در MNi موجود در روش CBMN
۳) جداول تیماری بررسی ژنوتوکسیک در شرایط این ویترو
۴) پیشرفت های آتی

چکیده
۳ در این فرم اصلی روش CBMV با استفاده از معیارهای انتخاب مورفولوژیکی ارائه می شود و این نوع سمیت ژنتیکی و سمیت سلولی مورد ارزیابی قرار می گیرد: شکست کروموزوم، از دست رفتن کروموزوم، نوآرایی فام تنی ( پل های نوکلئوپلاسمیک)، مهار تقسیم سلولی، نکروز و مرگ برنامه ریزی شده سلولی. تغییر سیتوزین-آرابینوزید روش CBMN امکان ارزیابی ضایعات قابل ترمیم حاصل از برش را فراهم می کند. استفاده از پروب های مولکولی تفکیک بین از دست رفتن کروموزوم و شکست کروموزوم و از همه مهتر کاستمان ( ناگسستگی) در سلول های دو هسته ای را میسر می سازد. در تکنیک این ویترو CBMN، سمیت ژنتیکی و سمیت سلولی به صورت متعدد و تکمیلی ارزیابی می شود که با کاهش نسبی در سیستم بدست می آید. اصول و روش های اصلی CBMN ( شامل معیارهای رتبه بندی دقیق برای نقاط پایینی سمیت ژنتیکی و سمیت سلولی) توصیف و حوزه کاری تحقیقات آینده نیز شناسایی می شود. 
۱٫ مقدمه
عوامل فیزیکی و شیمیایی باعث تغییرات اساسی در مواد ژنتیکی سلول های یوکاریوت می شوند و اولین نشانه تایید کننده این موضوع، آسیب DNA در اثر مواجه با تشعشعات یونی یا مواد شیمیایی سرطان زا بود. اگرچه درک ما ساختار کروموزوم کامل نیست اما شواهد نشان می دهد که ناهنجاری کروموزومی اثر مستقیم و نشانه آسیب در سطح DNA است، به عنوان مثال شکست کروموزوم ممکن است به علت شکست ترمیم نشده دو رشته DNA و نوآرایی کروموزوم در اثر نقص تعمیر شکست تک رشته DNA باشد. هم چنین مشخص شد که از دست رفتن کروموزوم و جدانشدن کروموزوم ها (کاستمان) رویدادهای مهمی در سرطان و پیری هستند و احتمالا به علت نقص در دوک، سانترومر یا در نتیجه عدم تراکم ساختار کروموزوم قبل از متافاز ایجاد می شوند.
در روش های قدیمی سیتوژنتیک، کروموزوم ها مستقیما با مشاهده و شمارش تعداد ناهنجاری موجود در متافاز مطالعه می شوند. این روش آنالیز دقیقی را ارائه می کند اما پیچیدگی و دشواری شمردن تعداد اختلال در متافاز و اثر مخدوش کننده از دست رفتن کروموزوم ها در نتیجه آماده سازی متافاز باعث ایجاد سیستم ساده تر ارزیابی آسیب DNA شده است.
اشمید و هدل به طور مستقل پیشنهاد دادند که روش جایگزین و ساده تر برای ارزیابی آسیب DNA در شرایط درون تنی ( این ویو) شمارش میکرونوکلئی (MNi) ، در هماتولوژی معروف به اجسام هاول- ژولی، در تقسیم جمعیت سلول هایی مثل مغز استخوان است. روش شمارش میکرونوکلئی در مغز استخوان و اریتروسیت های خون محیطی امروزه یکی از بهترین روش ها در ارزیابی سیتوژنتیک درون تنی در زمینه سم شناسی ژنتیکی ست اما برای سایر جمعیت های سلولی در شرایط درون تنی و آزمایشگاهی و روش هایی که تاکنون برای شمارش این ویتروی MNi در سلول های هسته دار ایجاد شده اند، مناسب نیست.
MNi در سلول های در حال تقسیمی بیان می شوند که یا در آن ها کروموزوم بدون سانترومر می شکند (قطعات خارج از مرکز) و یا کل کروموزوم موجود در آن ها قادر به حرکت به قطب دوک در طول میتوز نیست. در تلوفاز، یک پوشش هسته ای در اطراف کروموزوم ها و قطعات پیرو تشکیل می شود که این پوشش بعدا از حالت پیچشی خارج شده و به تدریج مورفولوژی یک هسته اینترفاز را نشان می دهند به جز اینکه آن ها کوچکتر از هسته اصلی سلول هستند، بنابراین اصطلاح میکرونوکلئوس ( شکل ۱) ، MNi شاخص مناسب و مطمئنی برای شکست کروموزوم و از دست رفتن کروموزوم می باشد. از آن جایی که MNi در سلول هایی که تقسیم‌ هسته ای خود را تکمیل کرده اند بیان می شوند، در حالت مطلوب در مرحله دو هسته ای سیکل سلولی قرار می گیرند. گاهی در یک سلول دو هسته ای، بین هسته ها پل های نوکلئوپلاسمیک مشاهده می شود. این ها احتمالا کروموزوم های دی سانتریک هستند که در آن ها دو سانترومر به قطب های مختلف سلول کشیده شده و در پل بوجود آمده DNA توسط غشای هسته ای پوشیده می شود ( شکل ۱). بنابراین پل های نوکلئوپلاسمیک موجود در سلول های دو هسته ای ارزیابی کامل تری از بازآرایی کروموزومی ارائه می کنند که می توانند همراه با تعداد میکرونوکلئوس محاسبه شوند.
از مطالب بالا می توان نتیجه گرفت که MNi تنها در سلول های یوکاریوتی در حال تقسیم بیان می شوند. به عبارت دیگر، این روش به طور موثر یا به طور کمی در جمعیت های سلولی که در حال تقسیم نیستند یا در جمعیت های سلولی در حال تقسیم که کینتیک تقسیم سلولی در آن ها به طور کامل بررسی یا کنترل نشده است مورد استفاده قرار نمی گیرد. در نتیجه، نیاز به ایجاد روشی بود که بتواند در یک جمعیت سلولی، بین سلول هایی که در حال تقسیم نیستند و سلول هایی که در حال میتوز هستند را تفکیک نماید. علاوه بر این، به علت عدم قطعیت سرنوشت MNi بعد از بیشتر از یک تقسیم هسته، شناسایی سلول هایی که تنها یک تقسیم سلولی را تکمیل کرده اند‌ مهم است. این پیش نیازها نیز ضروری هستند زیرا سلول ها بسته به شرایط مختلف فیزیولوژیکی، ژنتیکی و میکرو مغذی ها، با سرعت متفاوتی در شرایط درون تنی و این ویترو تقسیم می شوند.
چندین روش بر اساس استاتموکینتیک، فلوسیتومتری ( شمارش سلول ها) و روش های نشانه گذاری DNA پیشنهاد شده اند اما روشی که به علت سادگی و اطمینان بالا در زمینه تاثیر بر روی آسیب زمینه DNA ، مطلوب تر است روش شمارش میکرونوکلئی در سلول های متوقف شده در مرحله سیتوکیناز (CBMN) می باشد.

Abstract

The study of DNA damage at the chromosome level is an essential part of genetic toxicology because chromosomal mutation is an important event in carcinogenesis. The micronucleus assays have emerged as one of the preferred methods for assessing chromosome damage because they enable both chromosome loss and chromosome breakage to be measured reliably. Because micronuclei can only be expressed in cells that complete nuclear division a special method was developed that identifies such cells by their binucleate appearance when blocked from performing cytokinesis by cytochalasin-B (Cyt-B), a microfilament-assembly inhibitor. The cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay allows better precision because the data obtained are not confounded by altered cell division kinetics caused by cytotoxicity of agents tested or sub-optimal cell culture conditions. The method is now applied to various cell types for population monitoring of genetic damage, screening of chemicals for genotoxic potential and for specific purposes such as the prediction of the radiosensitivity of tumours and the inter-individual variation in radiosensitivity. In its current basic form the CBMN assay can provide, using simple morphological criteria, the following measures of genotoxicity and cytotoxicity: chromosome breakage, chromosome loss, chromosome rearrangement (nucleoplasmic bridges), cell division inhibition, necrosis and apoptosis. The cytosine-arabinoside modification of the CBMN assay allows for measurement of excision repairable lesions. The use of molecular probes enables chromosome loss to be distinguished from chromosome breakage and importantly non-disjunction in non-micronucleated binucleated cells can be efficiently measured. The in vitro CBMN technique, therefore, provides multiple and complementary measures of genotoxicity and cytotoxicity which can be achieved with relative ease within one system. The basic principles and methods (including detailed scoring criteria for all the genotoxicity and cytotoxicity end-points) of the CBMN assay are described and areas for future development identified.

۱٫ Introduction

The observation that chromosome damage can be caused by exposure to ionising radiation or carcinogenic chemicals was among the first reliable evidence that physical and chemical agents can cause major alterations to the genetic material of eukaryotic cells [1]. Although our understanding of chromosome structure is incomplete, evidence suggests that chromosome abnormalities are a direct consequence and manifestation of damage at the DNA level — for example, chromosome breaks may result from unrepaired double strand breaks in DNA and chromosome rearrangements may result from misrepair of strand breaks in DNA [2]. It is also recognised that chromosome loss and malsegregation of chromosomes (non-disjunction) are an important event in cancer and ageing and that they are probably caused by defects in the spindle, centromere or as a consequence of undercondensation of chromosome structure before metaphase [3–۵].

In the classical cytogenetic techniques, chromosomes are studied directly by observing and counting aberrations in metaphases [6]. This approach provides the most detailed analysis, but the complexity and laboriousness of enumerating aberrations in metaphase and the confounding effect of artefactual loss of chromosomes from metaphase preparations has stimulated the development of a simpler system of measuring chromosome damage.

It was proposed independently by Schmid [7] and Heddle [8] that an alternative and simpler approach to assess chromosome damage in vivo was to measure micronuclei (MNi), also known as Howell–Jolly bodies to haematologists, in dividing cell populations such as the bone-marrow. The micronucleus assay in bone-marrow and peripheral blood erythrocytes is now one of the best established in vivo cytogenetic assays in the field of genetic toxicology, however, it is not a technique that is applicable to other cell populations in vivo or in vitro and methods have since been developed for measuring MNi in a variety of nucleated cells in vitro.

MNi are expressed in dividing cells that either contain chromosome breaks lacking centromeres (acentric fragments) and/or whole chromosomes that are unable to travel to the spindle poles during mitosis. At telophase, a nuclear envelope forms around the lagging chromosomes and fragments, which then uncoil and gradually assume the morphology of an interphase nucleus with the exception that they are smaller than the main nuclei in the cell, hence the term “micronucleus” (Fig. 1). MNi, therefore, provide a convenient and reliable index of both chromosome breakage and chromosome loss. Because MNi are expressed in cells that have completed nuclear division they are ideally scored in the binucleated stage of the cell cycle [9,10]. Occasionally nucleoplasmic bridges between nuclei in a binucleated cell are observed. These are probably dicentric chromosomes in which the two centromeres were pulled to opposite poles of the cell and the DNA in the resulting bridge covered by nuclear membrane (Fig. 1). Thus, nucleoplasmic bridges in binucleated cells provide an additional and complementary measure of chromosome rearrangement, which can be scored together with the micronucleus count.

تکنیک میکرونوکلئوس در در شرایط آزمایشگاهی

The in vitro micronucleus technique