دگرگونی رشد قشر مخ پس از مواجهه پیش زادی با سیپرمترین و دلتامترین

Alteration of mice cerebral cortex development after prenatal exposure to cypermethrin and deltamethrin

Abstract

Pyrethroids, a group of insecticides with high efficiency, low toxicity and wide spectrum, are used for pest control in agriculture. Here, we administered two representative pyrethroids (cypermethrin and deltamethrin) and an equal volume of vehicle (corn oil) to the pregnant ICR mice. This study investigated the effects of cypermethrin and deltamethrin on cerebral cortex development in mice as well as possible mechanisms in proliferation and differentiation. The results showed that histopathologic change did not occurred in the cerebral cortex using Hematoxylin and Eosin staining, however, the observation of fetuses exposed to cypermethrin and deltamethrin revealed reduction of neuronal proliferation, maturation and differentiation. Moreover, cypermethrin/deltamethrin-induced apoptosis of nerve cell was significantly higher in treated groups than that in control group by using flow cytometry, Western blot and TUNEL. It was worth mentioning that the newborns exposed to cypermethrin and deltamethrin did not showed abnormal neuronal distribution. These findings suggested that prenatal cypermethrin and deltamethrin exposure impaired corticogenesis.

1 Introduction

Chemically synthesized pyrethroids, similar to the natural pyrethroids because of their chemical structure, can affect the function of organs through neurotoxicity (Crago and Schlenk, 2015), endocrine disruption (Jin et al., 2015), abnormal development (Jin et al., 2009) and reproductive toxicity (Wang et al., 2009) in animals. It is now widely used in agricultural pest control and household pest cleanup. The pyrethroids can be classified into type I and type II, and cypermethrin (CP) and deltamethrin (DM) are common pyrethroid II pesticides used worldwide in agriculture, home pest control and disease vector control. In addition, they are considered as an insecticide closely related to human health and food safety (Jin et al., 2015; Singh et al., 2012).

CP and DM accumulate in soil, and traces of them may appear in vegetables, tea, fruits and other foods. CP and DM also have stomach toxicity and brain toxicity (Ncir et al., 2017; Singh et al., 2012). Although long-term exposure to low dose of CP is not enough to cause obvious symptoms of poisoning, the potential damage for reproduction cannot be ignored because of accumulation (Muangphra et al., 2015). CP and DM cause morphometric and structural changes in the genital organs by reducing the number of follicular cells, oocytes and corpora lutea through dose-dependent effects (Marettova et al., 2017; Petr et al., 2013). The previous studies showed that relative toxic potency of six individual pyrethroids for cortical neurons was followed by beta-cyfluthrin, lambda-cyhalothrin, deltamethrin, cypermethrin, bifenthrin and permethrin by disrupting voltage-gated sodium channels and altering cell excitability (Chen et al., 2017; Johnstone et al., 2017; Mohana Krishnan and Prakhya, 2016). In addition, pyrethroids were correlated with carboxylesterase metabolism in liver (Anand et al., 2006), and next generation sequence was used to identify differentially expressed genes for precise molecular mechanisms (Mamidala et al., 2012; Zimmer et al., 2017). Although DM and CP are widely used in human activities, the mechanism of them on cortical neurogenesis remain unclear, so we want to investigate the effect of DM and CP on neuronal progenitor proliferation, cell maturation, neuronal differentiation, apoptosis and neuronal migration in mammalian.

Our results demonstrated that CP/DM exposure inhibited the proliferation of neural precursor cells and neural stem cells, and promoted cell apoptosis in vivo and in vitro. The cell fate decision of newborn neurons was affected by CP and DM, respectively. These findings may be helpful for understanding the neurotoxicity mechanisms of pyrethroids.

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

مبتنی بر مکانیستیک
گلوتامات دهیدروژناز (GLDH) یک آنزیم میتوکندری است که در کبد و با مقدار کمتر در کلیه و بسیار نادر در عضلات اسکلتی یافت میشود. این آنزیم بسیار ویژه-بافت تر از ALT و AST است. اشخاص سالم سطحی قابل اندازه گیری و ثابت از سرم GLDH دارند که با گذر سن و جنسیت تغییری نمیکند. یک افزایش در گردش GLDH نشان دهنده نارسایی در ناحیه میتوکندری و در نتیجه از بین رفتن یکپارچگی غشای میتوکندری است، که در خلال نکروز هپاتوسلولار روی میدهد. GLDH به خوبی با افزایش ALT هماهنگی دارد، مخصوصا در بیمارانی که آسیب های کبدی مختلف دارند، از جمله اوردز APAP، اما آنچنان حساس نیست تا سمیت کبدی APAP را پیش از ALT نشان دهد. علاوه بر این، داوطلبان سالم هپارین زیر پوستی دریافت میکردند که بنا بر گزارشات باعث افزاش در GLDH به همراه افزایش بدون علامت ALT میشد، این خود نشان دهنده رابطه بین GLDH و ALT است. نتایج مشابه برای مالات دهیدروژناز (MDH) هم مشاهده شده است، یک آنزیم تشکیل یافته در چرخه سیتریک اسید که پس از آسیب دیدن بافت به داخل سرم وارد میشود. با تمام اینها MDH بستگی کمتری به بافت دارد و سطح سرم آن با آسیب خارج کبدی تحت تاثیر قرار میگیرد.
HMGB1 یک پروتئین کروماتین-اتصال با فعالیت پیش التهابی تنظیم شده از طریق گیرنده های تولیک و گیرنده برای سیگنال دهی محصولات نهایی پیشرفته گلیکاسیون است. این پروتئین به صورت منفعلانه از سوی سلول های نکروتیک به فرم هایپوآستیلتید آزاد میشود، اما نه از سوی سلول های نکروتیک آپوپتوز یا ثانویه. بر خلاف آن، به صورت فعالانه در فرم هایپرآستیلات شده از سلول های مصون منتشر میشود. همچنین HMGB1 نوعی نماینده از سلول نکروز یا سلول مصون فعال شده بسته به شرایط استیله اش است. کراتین-18 عضوی از خانواده پروتئین کراتین است، که در ساختار سلولی و پیوستگی آن نقش دارد. بسیار شبیه به HMGB1، کراتین-18 با طول کامل دچار برآمدگی به واسطه کاسپاس میشود که بخشی از سازماندهی مجدد ساختاری در حین آپوپتوز بوده و پس از آن میتواند وارد جریان خون شود. پس مقادیر متمایز غلظت سرم از کراتین-18 هایی با طول کامل یا کاسپاس میتواند نشانی از سطح سلول نکروز و آپوپتوز دخیل باشد. شکل های مولکولی HMGB1 و K18 به عنوان نشانگرهای حساس به خون در آسیب های کبدی حاد تشخیص داده شده اند و میتوانند آگاهی خوبی نسبت به فرآیند مکانیستیک سمیت کبدی APAP از خود نشان دهند. این نشانگرهای زیستی از ALT هم حساستر تشخیص داده شده اند و با افزاش واضح پیش از ALT در بیمارانی که اوردز APAP دریافت کرده باشند. استفاده از نشانگرهای زیستی در درمان های پزشکی میتواند سرعت تصمیم گیری در رابطه با درمان را افزایش دهد. هرچند، ارزش و کاربرد پزشکی در موارد مرتبط با DILI ویژه همچنان ناشناخته باقی مانده است.
MicroRNA
MicroRNA ها (miRNAs) نوکلئوتید های کوچک غیر کد کننده RNA دخیل در تنظیمات پسا-رونویسی خصوصیات ژن هستند. آسیب به ارگان های بدن معمولا باعث انتشار miRNA ها در جریان خون و تا حدودی در ادرار میشوند که به طور معمول در مایعات زیستی ثابت است، ویژگی ای که باعث شده است miRNA ها توجهات بیشتری را به خود جلب کنند. از آنها به عنوان نشانگرهای زیستی غیر تهاجمی یاد میشود. تا کنون چندین مطالعه تغییر در مقدار سرم miRNA را پس از آسیب های کبدی نشان داده است. MiR-122 و miR-192 اولین miRNA هایی بوده اند که پس از دز های سمی APAP در موش مشاهده شده اند و کمی بعد هم رفتاری مشابه در انسان را از خود نشان داده اند. MiR-122 و miR-192 هر دو miRNAهای غنی در کبد هستند، گستردگی miR-122 با درصد 72% در موش ها گزارش شده است. سرم miR- 122 در اولین مراحل آسیب هپاتوسلولار در بیماران تازه بستری شده با اوردز APAP مشاهده شده است، حتی زمانی که ALT همچنان نرمال به نظر میرسید. این ویژگی miR-122 را به طور ویژه برای تشخیص بیماری و شناسایی کاندیدهای دارویی برای بیماران مستعد سمیت کبدی ارزشمند میسازد. همین مساله میتواند با نشانگرهای زیستی کنونی بدون تشخیص باقی بماند. علاوه بر این، miR-122 بیشتر حساس به کبد است تا ALT، همانطور که در گروه آزمایشاتی انسانی نشان داده شده است. برای مثال در آسیب های عضلانی میزان miR-122 ثابت باقی ماند در حالیکه میزان ALT دچار تغییر شده بود.
داده تازه نشان میدهد miRNA-122 میتواند ارزش پیش بینی کننده نیز داشته باشد، این موضوع با سطوح بالای اوردز APAP در بیمارانی که تحت معیارهای کالج کینگ واجد پیوند کبد شناخته شده بودند، بررسی شده است. هر چند ارزش miR-122 برای DILI ویژه هنوز مورد مطالعه است. لازم به ذکر است در حالیکه miR-122 به عنوان یک نشانگر زیستی DILI حامل خونی حساس عملکرد خوبی دارد، سطح ادرار miRNA ها پس از اوردز APAP افزایش محسوسی ندارند، نه در حیوانات و نه در انسان. یافته های اخیر همچنین نشان میدهند سرم miRNA، به جای miRNAهای تکی ارزش تشخیص بالاتری دارد. این یافته بر اساس تست 11 miRNA مختلف در بیماران مبتلا به آسیب کبدی حاد با علل مختلف کسب شده است.
اگزوسومز
در حالیکه miRNAها میتوانند به صورت منفعلانه و در حین نکروتیک و یا آپوپتوز سلول مرده وارد جریان خون شوند، انتشار فعالانه شان هم میتواند بوسیله اگزوسومزها صورت گیرد. اگزوسومزها یکی از اشکال ساختار اطراف غشای سلولی هستند که تقریبا از سوی هر نوع سلولی آزاد میشوند. نقش کامل اگزوسومز در کنار انتقال و تحویل مواد مختلف از قبیل مولکولهای سیگنال رسان و زباله سلولی همچنان در حال بررسی است. مواد تشکیل دهنده اگزوسومزها محدود به miRNA نمیشوند بلکه حاوی پروتئین، لیپید و نوکلئیک اسیدهای اضافی (miRNAها) نیز میشود. اگزوسومزها اخیرا یکی از مهمترین مناطق تحقیق در پی یافتن نشانگرهای زیستی مناسب برای عارضه DILI بوده اند، به این خاطر که ترکیبات سازنده اگزوسومزها تحت فشار سلولی دچار تغییر میشود. اگزوسومزهای در حال چرخش نشات گرفته از بافت های مختلف در بسیاری از مایعات بدن یافت میشوند، خون و ادرار منابع بهتری برای نشانگرهای زیستی غیر تهاجمی هستند. چالش عمده در تشخیص اگزوسومزهای مشتق شده از سلولهای کبدی است. در کنار این نتایج امیدوار کننده ای با استفاده از مدلهای حیوانی برای نشان دادن افزایش در اگزوسومزهای mRNA های مختص کبد و miRNA های غنی در کبد یافت شده است. جالبتر اینکه با وجود تشخیص افزایش سطح miR-122 و miR-155 در سرم غنی از اگزوسومز / تکه های پلاسما در موش با آسیب کبد ناشی از مصرف الکل یا لیپوپلی ساکارید، این miRNA ها در سرم / تکه های پلاسمای غنی از پروتئین موش هایی با اوردز APAP با افزایش روبرو میشوند. این یافته نشان میدهد الگوی توزیع miRNA میتواند بسته به علل متفاوت باشد. تنوع در miRNA های مشتق شده از اگزوسومزها هم در شرایط کبدی مختلف گزارش شده است، از جمله هپاتیت مزمن و رایج بی و سی و استئاتوهپاتیت غیر الکلی در مقایسه با کنترلهای سالم. علاوه بر این الگوی رفتاری miRNA برای انعکاس مرحله تصلب بافت ها و درجه التهاب کبد در بیماران مبتلا به هپاتیت سی مزمن مشاهده شده است.

نشانگرهای زیستی مشتق شده از «امیکز »
به لطف تکنولوژی امیکز رویکرد جدیدی برای مطالعات نشانگرهای زیستی ایجاد شده است. قابلیت مشاهده تعداد بالایی از مولکول ها (برای مثال متابولیت ها، پروتئین و یا DNA) به طور همزمان تشخیص «میزان سمی بودن » را ممکن میسازد که به نوبه خود در ارزیابی های ایمنی و تشخیص بیماری کمک شایان توجهی به شمار میرود. متابولومیک تکنیک مناسبی به شمار میرود، معمولا از طریق اسپکتومتری یا طیف سنجی رزونانس مغناطیسی هسته ای. این تکنولوژی ارزیابی کلی تغییرات متابولیک را ممکن ساخته و شناسایی خصوصیات متابولیک مرتبط با آن را سهولت میبخشد، برای مثال بیماری ها یا واکنش های درمانی. تکنولوژی متابولومیک برای شناسایی کاندیدهای نشانگر زیستی در بسیاری از بیماری های کبدی به کار میرود. از جمله این بیماری های رایج کبد میتوان به کبد چرب فاقد الکل، استئاتوز، فیبروز، سیروز، سرطان کبد، و کلانژیوکارسینومای اشاره کرد. علاوه بر این، یک مقایسه بین خصوصیات متابولیک پلاسما بیماران مبتلا به هپاتیت خود ایمنی، سیروز صفراوی اولیه، التهاب هپاتیت اتوایمون / سندرم سیروز صفراوی اولیه همپوشانی شده، DILI و کنترل های سلامتی منجر به ایجاد فنوتایپ هپاتیت خود ایمنی متابولیک با حساسیت بیش از 93% شده است. به همین ترتیب سرم Y-گلوتامیل به عنوان نشانگر زیستی مستعد برای تفکیک گونه های مختلف بیماری های کبدی معرفی شده اند.
هرچند، در حوزه سمیت کبدی، مطالعات متابولومیک انجام شده تا امروز بیشتر محدود به DILI ذاتی در حیوانات یا مدل های مجازی بوده اند. یک رنگ نگاری مایع با عملکرد بالا یا تحلیل اسپکتومتری از درمان موش با سرم گالاکتوزامین تفاوت هایی در برخی متابولومیک ها نشان داده است، از جمله آمینو اسیدها و لیپیدهای غشای سلولی در مقایسه با کنترل موش ها. برخی از این یافته ها با درجه بافت شناسی تعیین شده از شدت آسیب کبدی همخوانی دارند. مطالعه ای مشابه از نمونه دریافت شده از موش های تحت درمان با دارو نشان دهنده افزایش سطح اسید صفرا به علاوه چندین تغییر متابولیت دیگر میشود که در کنار نشانگرهای شیمیایی پزشکی سنتی میتواند دقت و قابلیت اتکای تشخیص سمیت کبدی را افزایش دهد. مطالعات اخیر بر روی حیوانات نشان دهنده برتری خصوصیات متابولیک بر متابولیت های تکی هستند که میتوانند سمیت کبدی که شامل سمیت کبدی ویژه هم میشود را نیز پیش بینی کنند.
دسته بندی متابولیک از ادرار هم برای یافتن متابولیت های مرتبط با عارضه DILI صورت گرفته است. داوطلبان سالم سطوح غیر سمی از APAP داخل ادرار و ترکیبات متابولیک پلاسما ارائه کردند، هم پس از مقایسه قبل و هم بعد از نمونه گیری دز. در طول کل بررسی ها این سطوح غیر سمی بیشتر به تغییرات پارامترهای بیوشیمیایی داخل سرم حساسیت نشان میدادند. لازم به ذکر است با اینکه بسیاری از مطالعات متابولیک انجام شده تا این تاریخ به دنبال یافتن انواع متابولیت های درون زاد بوده اند، اما متابولیت های شناسایی شده معمولا بین آثار تحقیقاتی متفاوت هستند. تفاوت در طراحی مطالعه در کنار درمان های مختلف میتواند به چنین تفاوت هایی منتهی شود. حتی باید در ذهن داشت که تفاوت های بینافردی بین متابولومیک ها رایج بوده و میتوانند نشان دهنده تنوع در شرایط محیطی و شرایط پذیرنده بین موضوعات مختلف باشند. با همه اینها، متابولومیک ها میتوانند یک روش عملی برای شناسایی بیماران DILI باشند، حتی در مدت کوتاهی از شروع درمان با یک داروی خاص و در نتیجه همه اینها خطر آسیب جدی به کبد را به خاطر قطع درمان با مشاهده تغییرات متابولیک بخصوص کاهش دهند. در کنار متابولومیک ها، پروتئومیکس هم در جستجوی نشانگرهای زیستی DILI میتواند مسمر ثمر باشد. یک مقایسه کاوشگرانه در سرم کلی پروتئومیکس DILI نتایج قابل توجهی با آپولیپوپروتئین E نشان داده است که نشان میدهد قدرت زیادی در ایجاد تمایز بین کنترل های DILI دارد. در حالی که کدهرین 5 و اسید چرب متصل کننده پروتئین 1 مرتبط با DILI با استفاده از رویکرد چینش تسبیحی یک آنتی بادی موفق به حصول این نتیجه شده اند. به همین ترتیب مطالعات مرتبط با طیف ژنوم در گروه مطالعاتی DILI منجر بوجود آمدن تعدادی آلل های HLA شده اند که به نظر مرتبط با فرم های مشخصی از عارضه DILI میشود. این آلل ها که ارزش های پیش بینی کننده منفی بالایی دارند میتوانند به عنوان نشانگرهای زیستی جهت شناسایی DILI و یا تشخیص عامل مسبب در بیمارانی شوند که بیش از یک عامل سمیت کبدی دریافت میکنند، و در نتیجه اینها روند تشخیص DILI را سرعت بخشند. هر چند، شکل های DILI مرتبط با HLA بیشتر محدود به عامل های مسبب متداول میشوند و بسیاری از انواع DILI ارتباط مستحکم کمی با HLA پیدا میکنند.
چشم اندازهای آینده
آلانین آمینوترانسفراز، آسپارتات آمینوترانسفراز، آلکالن فسفاتاز و بیلی روبین توتال تا امروز تنها نشانگرهای زیستی شناخته شده برای عارضه DILI در درمان های پزشکی هستند. با اینکه این نشانگرها نقش پر رنگی در تشخیص بیماری ها دارند، اما صرفا برای سمیت کبدی تعبیه نشده اند، افزایش این مقادیر بیوشیمیایی در تمامی شرایط کبدی به چشم میخورد. علاوه بر این این نشانگرهای زیستی فاقد حساسیت کمی در قبال ایجاد آسیب کبدی دارند پس برای تشخیص زود هنگام و پیش بینی این قبیل آسیب ها چندان کاربرد ندارند. این نکته اهمیت بالایی در آزمایشات پزشکی دارد. حضور نشانگرهای زیستی DILI با تخصص ارتقا یافته و حساسیت بیشتر میتواند داروهای مستعد ایجاد سمیت کبدی را در مراحل اولیه شناسایی کند. همین مساله میتواند باعث کاهش تاثیرات سو دارو در مراحل پایانی درمان شده و از جمع آوری دارو از بازار جلوگیری کند. علاوه بر این چنین نشانگرهای زیستی میتواند ایمنی بیمار را بالا ببرد، به خاطر نظارت ارتقا یافته در حین شروع درمان و همچنین تشخیص سریع و دقیق DILI.