|
دانلود رایگان مقاله انگلیسی + خرید ترجمه فارسی
|
|
| عنوان فارسی مقاله: | تولید اسید آرتمیزینیک، پیش ساز داروی آنتی مالاریا در مخمر مهندسی شده |
| عنوان انگلیسی مقاله: | Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast |
| مشخصات مقاله انگلیسی (PDF) | |
| سال انتشار مقاله | 2006 |
| تعداد صفحات مقاله انگلیسی | 4 صفحه با فرمت pdf |
| رشته های مرتبط با این مقاله | پزشکی، داروسازی، شیمی و زیست شناسی |
| گرایش های مرتبط با این مقاله | شیمی دارویی، فارماکوگنوزی، سم شناسی، داروشناسی، فارماسیوتیکس (دارو سازی صنعتی)، بیوتکنولوژی دارویی، علوم سلولی و مولکولی، شیمی تجزیه، شیمی دارویی، شیمی کاتالیست و زیست فناوری (بیوتکنولوژی) میکروبی |
| مجله مربوطه | مجله بین المللی علوم تجربی (international journal of science nature) |
| دانشگاه تهیه کننده | مرکز زیست شناسی مصنوعی برکلی، آزمایشگاه ملی لارنس، دانشگاه کالیفرنیا، ایالات متحده |
| نشریه | Nature |
| مشخصات و وضعیت ترجمه مقاله (Word) | |
| تعداد صفحات ترجمه مقاله | 14 صفحه با فرمت ورد، به صورت تایپ شده و با فونت 14 – B Nazanin |
| ترجمه اشکال | ترجمه توضیحات زیر اشکال انجام شده و اشکال به صورت عکس در فایل ترجمه درج شده است. |
فهرست مطالب:
روش ها
آنالیز GC–MS آمورفادین
ردیابی ها یا تست های آنزیمی درون شیشه ای
بخشی از ترجمه:
آنالیز محصول و تخمیر: بیوراکتور یک لیتری(New-Brunswick Scientific) برای کشت سویه مخمر تراژنی به مدت 93 ساعت در دمای 30 درجه استفاده شد. سلول های مخمر با 2 درصد گالاکتوز در A600 با مقدار 1.7 و تراکم سلولی نهایی 5 القا شدند. سطح اکسیژن انحلالی در 40 درصد با تغییر سرعت آشفتگی یا هم زنی از 100 تا 500 دور بر دقیقه و جریان هوای 0.51 لیتر بر دقیقه حفظ شد. اسید آرتمیزنیک از پلت سلول با شست و شوی قلیایی حذف و توسط ستون سیلسسیم رقیق شده با 78 درصد هگزان، 20 درصد اتیل استات و 2 درصد اسید استیک تخلیص شد. ساختار اسید آرتمیزنیک تخلیص شده ( خلوص بیش از 95 درصد) توسط H و C13 با استفاده از طیف سنج 500 MHz NMR(Bruker DRX-500) در آزمایشگاه دانشکده شیمی NMR در دانشگاه کالیفرنیا تجزیه تحلیل شد.
ردیابی ها یا تست های آنزیمی درون شیشه ای: محیط کشت یک لیتری S. cerevisiaeYPH499 ترانسفورم شده با pESCURA::CPR و pESCURA::CPR/CYP71AV1 با 2 درصد گالاکتوز به مدت 24 ساعت القا شد. میکروکوزم ها یا نمونه ها نوسط رسوب گلیکول پلی اتیلن تخلیص و سپس تحت الترا سانتریفیوژ برای حذف آلودگی پروتینی سیتوسولیک که قبلا توصیف شده بود قرار گرفتند(26). تقریبا 500 میکرو گرم از نمونه پروتین کل در بافر فسفات پتاسیم 1 میلی لیتری با اسیدیته 7.5% و سوبسترای 10 و 25 میکرومول، 100mM NADPH، و سیستم باززایی NADPH استفاده شد( 5 میلی مول گلوکز-6- فسفات و دو واحد گلوکز-6- فسفات دی هیدروژناز). واکنش ها به مدت 2 ساعت در دمای 24 درجه با هم زنی آرام انکوبات و به اسیدیته 2 رسانده شده و با اتیل اتر عصاره گیری شدند. محصولات با استفاده از برنامه آون کراماتوگرافی گازی مشابه که در بالا گفته شد تفکیک شدند. حالت یون انتخابی SIM از جمله شش یون مشخص محصولات(121, 189, 204, 218, 220 و 248) برای تشخیص استفاده شدند.
بخشی از مقاله انگلیسی:
1) engineering the farnesyl pyrophosphate (FPP) biosynthetic pathway to increase FPP production and decrease its use for sterols, (2) introducing the amorphadiene synthase gene (ADS) from A. annua into the high FPP producer to convert FPP to amorphadiene, and (3) cloning a novel cytochrome P450 that performs a three-step oxidation of amorphadiene to artemisinic acid from A. annua and expressing it in the amorphadiene producer (Fig. 1). The first committed reaction in artemisinin biosynthesis is catalysed by ADS10, which has been characterized and used for de novo production of amorphadiene in Escherichia coli11. To test for improvements in FPP production, we expressed ADS under the control of the GAL1 promoter on the pRS425 plasmid (see Supplementary Information for details). Yeast engineered with ADS alone produced a low quantity of amorphadiene (Fig. 2, strain EPY201, 4.4 mg l21 amorphadiene). To increase FPP production in S. cerevisiae, the expression of several genes responsible for FPP synthesis was upregulated, and one gene responsible for FPP conversion to sterols was downregulated. All of these modifications to the host strain were made by chromosomal integration to ensure the genetic stability of the host strain. Overexpression of a truncated, soluble form of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (tHMGR) 12 improved amorphadiene production approximately fivefold (Fig. 2, strain EYP208). Downregulation of ERG9, which encodes squalene synthase (the first step after FPP in the sterol biosynthetic pathway), using a methioninerepressible promoter (PMET3) 13 increased amorphadiene production an additional twofold (Fig. 2, strain EPY225). Although upc2-1, a semi-dominant mutant allele that enhances the activity of UPC2 (a global transcription factor regulating the biosynthesis of sterols in S. cerevisiae) 14, had only a modest effect on amorphadiene production when overexpressed in the EPY208 background (Fig. 2, strain EPY210), the combination of downregulating ERG9 and overexpressing upc2-1 increased amorphadiene production to 105 mg l21 (Fig. 2, strain EPY213). Integration of an additional copy of tHMGR into the chromosome further increased amorphadiene production by 50% to 149 mg l21 (Fig. 2, strain EPY219). Although overexpression of the gene encoding FPP synthase (ERG20) had little effect on total amorphadiene production (Fig. 2, strain EPY224), the specific production increased by about 10% owing to a decrease in cell density. Combining all of these modifi- cations resulted in a strain (EPY224) able to produce 153 mg l21 amorphadiene, a sesquiterpene production level nearly 500-fold higher than previously reported15. To create a strain that produced artemisinic acid from amorphadiene, we isolated genes encoding enzymes responsible for oxidizing amorphadiene to artemisinic acid in A. annua. Artemisinin is a sesquiterpene lactone derivative, which is the most widespread and characteristic class of secondary metabolites found in Asteraceae (also known as Compositae)16. We hypothesized that plants belonging to the Asteraceae family would share common ancestor enzymes for the early steps in the biosynthesis of sesquiterpene lactones, and therefore undertook a comparative genomic analysis of plants in the Asteraceae family. Previous cell-free assays have indicated that a cytochrome P450 monooxygenase (P450) catalyses the first regiospecific hydroxylation of amorphadiene (Fig. 1) in A. annua17. We thus retrieved P450-expressed-sequence tags (ESTs) from the Asteraceae EST-database generated from two Asteraceae crops, sunflower and lettuce (http://www.cgpdb.ucdavis.edu). Use of degenerate primers highly specific to the Asteraceae CYP71 and CYP82 subfamilies (the most abundant P450 subfamilies in Asteraceae) enabled the isolation of several unique P450 fragments from an A. annua trichome-enriched complementary DNA pool. Using BLAST18 analyses of these P450 gene fragments against sunflower and lettuce ESTs, we identified a single A. annua P450 gene fragment that had surprisingly high sequence identity (85–88% at the amino-acid level) to ESTs of unknown function from both sunflower and lettuce. Sequence identity of this A. annua P450 fragment to other P450 fragments outside the Asteraceae family was much lower (,50% at the amino-acid level), indicating that this P450 is highly conserved in three distantly related genera in the Asteraceae family, but not in plants outside the Asteraceae family. This P450 gene was therefore a good candidate for a conserved Asteraceae sesquiterpene lactone biosynthetic enzyme.
|
دانلود رایگان مقاله انگلیسی + خرید ترجمه فارسی
|
|
| عنوان فارسی مقاله: | تولید اسید آرتمیزینیک، پیش ساز داروی آنتی مالاریا در مخمر مهندسی شده |
| عنوان انگلیسی مقاله: | Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast |
