دانلود ترجمه مقاله طراحی پرایمر برای PCR کمی و زمان واقعی برای کروناویروس در حال ظهور SARS-CoV-2 (سال 2020)

طراحی پرایمر برای PCR کمی و زمان واقعی برای کروناویروس در حال ظهور SARS-CoV-2

Primer design for quantitative real-time PCR for the emerging Coronavirus SARS-CoV-2

چکیده
مقدمه
چند مطالعه در رابطه با فرایند تشخیص SARS-CoV-2
توالی مرجع و از بین رفتن پرایمرهای SARS-CoV-2
ضرورت طراحی یک توالی مرجع
ایجاد توالی مرجع
ضرورت طراحی پرایمرهای از بین رفته
طراحی پرایمرهای از بین رفته
تجزیه و تحلیل پرایمرهای و کاوشگرهای از قبل گزارش شده
مقایسه ژن های هدف: ژن E، ORF 1 ab و ژن N
بهبود حساسیت تست RT-qPCR
اصول کلی استراتژی طراحی پرایمر/کاوشگر
نتیجه گیری
منابع

چکیده
در دسامبر 2019، یک بیمار کروناویروس جدید (COVID-19) در ووهان چین شیوع پیدا کرد. سندرم کروناویروس-2 حاد تنفسی (SARS-CoV-2) که هفتمین کروناویروس شناخته شده عفونی انسان است، بسیار واگیر بوده و از زمان کشف آن به سرعت در سراسر جهان گسترش یافته است. تست کمی نوکلئیک اسید استانداردی طلایی برای تشخیص و هدایت تصمیمات بالینی با توجه به درمان ضدویروسی است. اگرچه آزمایشات RT-qPCR، SARS-CoV-2 را هدف قرار می دهند دارای چالش هایی نیز هستند، به ویژه در رابطه با طراحی پرایمر. پرایمرها اجزای کلیدی تست RT-qPCR هستند. وقتی جهش ویروسی و بازآرایی رخ می دهد، تشخیص موثر عفونت ویروسی از طریق پرایمرهای RT-qPC موجود دشوار است. برخی پرایمرها و کاوشگرها در وبسایت WHO برای مراجعه وجود دارند. با این وجودف هیچ بررسی سیستماتیکی در مقایسه با پرایمرها و کاوشگرهای گزارش شده از قبل وجود ندارد توضیحی وجود ندارد که پرایمرهای جدید در زمان شیوع آلودگی کرونایروس چطور طراحی می شوند. این مطالعه بر روش و عقلانی بودن نحوه طراحی کاوشگرها و پرایمرها تاکید دارد، و نشان می دهد که چطور حساسیت و اختصاصیت فرایند شناسایی می تواند بهبود پیدا کند. این مطالعه مروری مختصر برای تشخیص صحیح و درمان عفونت کروناویروس جدید مفید است.

چند مطالعه در رابطه با فرایند تشخیص SARS-CoV-2
در حال حاضر، توالی های ژنی شش کروناویروس شناخته شده منتشر شده است (HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoVHKU1, HCoV-OC43,MERS-CoV, and SARS-CoV) و پرایمرها و کاوشگرها می توانند بر اساس اطلاعات ژنومی موجود طراحی شوند. وقتی یک کروناویروس ناشناخته به طور ناگهانی ظاهر می شود و نوع جدیدی از آلودگی مسری را سبب مب شود، چطور باید واکنش نشان دهیم؟ در چنین شرایطی، طراحی پرایمرهای موثر با اختصاصیت و حساسیت بالا می تواند ارزش بالایی در تشخیص، ردیابی و پیگیری داشته باشد. طراحی پرایمرهای SARS-CoV-2 و کاوشگرها و فرایند تجزیه و تحلیل گام به گام برای تشخیص درست ویروس در شکل 1 نشان داده شده است.

ژانگ و همکاران اولین افرادی بودند که تمام طول توالی ژنومی ویروس SARS-CoV-2 را تعیین کردند (18). در 26 دسامبر، شش روز بعد از وقوع بیماری، یک مرد 41 ساله با تب، سرفه خشک، درد و ضعف به بیمارستان مرکزی ووهان مراجعه کرد. مایع لاواژ برونکوآلوئولار (BALF) برای انجام توالی عمیق رونوشت برداری متا جمع-آوری شد. پرایمرهای مورد استفاده برای RT-qPCR بر اساس کل ژنوم کروناویروس WH-Human 1 طراحی شدند (MN908947). توالی های مرجع مفصل از RNA ویروسی (بانک ژن MN908947) در جدول 1 نشان داده شده است. توالی ژنومی عامل کروناویروس جدید از طریق سازمان جهانی برای به اشتراک گذاشتن همه داده-های آنفلوانزا (GISAID) (http://www. gisaid.org/) از 12 ژوئن 2020 منتشر شد (32). پس از آن تعدادی از سایر توالی های SARS-CoV-2 منتشر شدند. این توالی های یافت شده تقریباً همسان بوند (17).

در یکم ژانویه 2020، کورمان و همکاران، از همبستگی نزدیک بین SARS-CoV-2 و ژنوم های SARS کروناویروس برای تولید مصنوعی توالی 2019-nCoV و ایجاد یک فرایند تشخیص آزمایشگاهی در نبود ویروس جدا شده استفاده کردند (33). در 10 ژانویه 2020، چن و همکاران دو بیماری دارای تب، علائم تنفسی و ارتشاح ریوی در رادیوگرافی قفسه سینه را گزارش کردند که که بیمارستان دانشگاه هونگ کونگ-شنزن کار می کردند. پس از آن، بین 11م تا 15م ژانویه 2020، 5 عضو دیگر از خانواده بیمار برای ارزیابی بالینی به بیمارستان آورده شدند (19). اولین مجموعه از پرایمرها 344 bp از ژن RdRp را در همه کروناویروس های مرتبط با SARS را هدف قرار دادند. سپس، این نمونه های بالیمی مثبت توسط توالی های نانوحفره مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و مجموعه دوم پرایمرها از توالی ژنوم SARS-CoV-2 طراحی شدند و یک ناحیه 158 bp ژن درهم پیچیده (S) این کروناویروس جدید را هدف قرار می دهد (19). علاوه بر این، Won et al پرایمرهایی را بر اساس توالی اولین بیمار آلوده شده با SARS-CoV-2 در کره طراحی کردند (34.35). در 22 ژانویه 2020، توالی بارگیری شده و کروناویروس های سارس، کروناویروس های شبه سارس خفاش، و سایر کرونا ویروس های شاخص در میان اولین توالی عمومی موجود در بانک ژن (شماره ورودی: MN908947) ویرایش و مرتب شدند. دو ناحیه توالی (ORF1b و N) که در میان ساربوکروناویروس ها به شدت حفاظت شده هستند برای طراحی پرایمر و کاوشگر در این مطالعه توسط Chu et al. انتخاب شدند (14). در 14 فوریه 202، 95 توالی ژنومی کامل از سویه های SARS-CoV-2 از پایگاه داده NCBI و GISAID استخراج شدند و یک توالی مرجع منتشر شد. محققان دریافتند که تنوع کل در نواحی ORF پایین بود؛ 13 محل متنوع در نواحی 1a، 1b, S, 3a, M, 8 و N شناسایی شد، در میان این موقعیت ها nt28144 در ORF8 و nt8782 در ORF 1a به ترتیب نشاندهنده نرخ جهش 30.53% (29/95) و 29.47% (28/95) هستند (36). ممکن است جهش های انتخابی در SARS-CoV-2 وجود داشته باشد و لازم است تا از نواحی خاص در زمان طراحی پرایمر و کاوشگر اجتناب شود.