دانلود ترجمه مقاله گیاهان به عنوان منبع انواع بوتریل کولین استراز طراحی شده برای افزایش فعالیت هیدرولاز کوکائین – الزویر ۲۰۱۳

گیاهان به عنوان منبع انواع بوتریل کولین استراز طراحی شده برای افزایش فعالیت هیدرولاز کوکائین

Plants as a source of butyrylcholinesterase variants designed for enhanced cocaine hydrolase activity

مقدمه

۱- مقدمه

۲- مواد و روش ها

۲-۱- کلونینگ کدکنندگی بیان ژن های سنتزی گیاه با بیان بهینه شده

واریانت های BChE و بیان آن ها در گیاهان

۲-۲- افزایش پری پارسیون واریانت های BChE و تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی

۲-۳- تست های آنزیمی

تتایج و بحث

چکیده

اعتیاد به کوکائین به میلیون ها نفر از طریق عوارض فاجعه بار شخصی و اجتماعی، آسیب می رساند. کوکائین یکی از تقویت کننده ترین داروهای سوءاستفاده است و حتی در کسانی که توانبخشی را تجربه کرده و دوره های طولانی پرهیز را تجربه می کنند، در بیش از ۸۰ درصد موارد احتمال عود وجود دارد. با این وجود هیچ درمان تایید شده-ای توسط FDA برای کاهش احتمال عود بیماری در معتادان توابنخشی شده وجود ندارد. با این حال، مطالعات اخیر نشان داده است که یک گزینه امیدوارکننده، درمان با کمک آنزیم بوتیریل کولین استراز سرم ( BChE) است که می تواند (-)-کوکائین را قبل از این که ماده مخدر بتواند بر مراکز مربوطه در مغز یا سایر قسمت های بدن تاثیر بگذارد، به طور طبیعی از بین ببرد. این فعالیت آنزیم بوتیریل کولین استراز نوع وحشی (WT ) نسبتا کم است. این امر موجب طراحی واریانت های بوتیریل کولین استرازی می شود که به طور قابل توجهی باعث افزایش فعالیت علیه (-)-کوکائین می شود. یک روش امیدوارکننده برای تولید مقدار زیادی از این واریانت های هیدرولاز BChE هستند که ارزان قیمت و ایمن بوده و هیچ گونه نگرانی در مورد پاتوژن های انسان نداشته و عملکرد آن معادل آنزیم های مشتق شده از منابع دیگر است. در اینجا، در بیان موتانت های BChE هیدرولیزکننده ی کوکائین در Nicotiana benthamiana با استفاده از سیستم بیان موقت MagnICON همراه با ویروس و ارائه گزارش در مورد آنالیز اولیه بیوشیمیایی، این اصل اثبات شد که گیاهان می توانند پروتئین های BChE مهندسی-شده با خواص مورد نظر را بیان کنند.

۲-۳- تست های آنزیمی

دو آزمایش آنزیمی انجام شد. آزمایش اسپکتروفتومتری Ellman برای ارزیابی فعالیت اولیه BChE با BTC (Sigma) به عنوان سوبسترا (۱ میلی مول)، انجام شد. همان طور که قبلا شرح داده شد، آزمایش ها در دمای ۳۰ درجه سلسیوس در اسپکتروفتومتر Spectramax 190 (Molecular Devices) انجام شد [۸]. برای ارزیابی هیدرولیز کوکائین، یک آزمایش رادیومتری که قبلا توصیف شده بود، با کوکائین ۳H به عنوان سوبسترا در گستره وسیعی از غلظت ها مورد استفاده قرار گرفت [۲]. تجزیه و تحلیل رگرسیون غیر خطی روی داده ها انجام شد (Sigma-Plot)، و تخمین VMAX و KM همراه با خطای استاندارد آنها محاسبه شد. می توان اعداد Turnover (KCAT) را به نوبه ی خود از این مقادیر VMAX به دست آورد و غلظت های مولار واریانت های BChE در آزمایش همانطور که در بالا شرح داده شد، به دست آمد.

Abstract

Cocaine addiction affects millions of people with disastrous personal and social consequences. Cocaine is one of the most reinforcing of all drugs of abuse, and even those who undergo rehabilitation and experience long periods of abstinence have more than 80% chance of relapse. Yet there is no FDA-approved treatment to decrease the likelihood of relapse in rehabilitated addicts. Recent studies, however, have demonstrated a promising potential treatment option with the help of the serum enzyme butyrylcholinesterase (BChE), which is capable of breaking down naturally occurring (−)-cocaine before the drug can influence the reward centers of the brain or affect other areas of the body. This activity of wild-type (WT) BChE, however, is relatively low. This prompted the design of variants of BChE which exhibit significantly improved catalytic activity against (−)-cocaine. Plants are a promising means to produce large amounts of these cocaine hydrolase variants of BChE, cheaply, safely with no concerns regarding human pathogens and functionally equivalent to enzymes derived from other sources. Here, in expressing cocaine-hydrolyzing mutants of BChE in Nicotiana benthamiana using the MagnICON virus-assisted transient expression system, and in reporting their initial biochemical analysis, we provide proof-of-principle that plants can express engineered BChE proteins with desired properties.

۲-۳- Enzymatic assays

Two enzyme assays were performed. The spectrophotometric Ellman assay was used to assess basic BChE activity with BTC (Sigma) as the substrate (1 mM). Assays were run at 30 C in a Spectramax 190 spectrophotometer (Molecular Devices) as previously described [8]. To evaluate cocaine hydrolysis, a previously described radiometric assay was used with 3 H cocaine as substrate over a wide range of concentrations [2]. Data were subjected to non-linear regression analysis (Sigma-Plot), and estimates of VMAX and KM were derived along with their standard errors. Turnover numbers (KCAT) could be derived, in turn, from these VMAX values and the assay’s molar concentrations of BChE variants obtained as described above.

تصویری از مقاله ترجمه و تایپ شده در نرم افزار ورد

گیاهان به عنوان منبع انواع بوتریل کولین استراز طراحی شده برای افزایش فعالیت هیدرولاز کوکائین

Plants as a source of butyrylcholinesterase variants designed for enhanced cocaine hydrolase activity