دانلود ترجمه مقاله آنالیز مولکولی شکار – وایلی ۲۰۰۸

آنالیز مولکولی شکار: بررسی بهترین شیوه برای رویکردهای مبتنی بر DNA

Molecular analysis of predation: a review of best practice for DNA-based approaches

چکیده

مقدمه

نمونه برداری

جمع آوری و تله گذاری شکارگرها

جمع آوری نمونه های مدفوع

حفظ و ذخیره سازی نمونه

آماده سازی نمونه

تشریح یا عدم تشریح

پردازش مدفوع

استخراج DNA

ژن های هدف

DNA هسته ای در مقابل DNA میتوکندریایی

انتخاب ژن میتوکندریایی

چند نمونه باید قبل از طراحی پرایمر توالی یابی شود؟

کپی های هسته ای

طراحی پرایمرها

بهینه سازی روش و ارزیابی

بهینه سازی برای به حداقل رساندن تکثیر تقاطعی غیر هدف

آزمون های حساسیت

آزمون تکثیر تقاطعی روی موجودات غیرهدف

غربالگری شکارها

اهمیت کنترل ها

آلودگی

غلبه بر مهار PCR

PCR مولتی پلکس و Singleplex

تجسم محصولات PCR

سیستم های ژل و آغازگرهای فلورسنت

DGGE و TGGE

سیستم های کمی

آزمایش های تغذیه ای تنظیمی برای تعیین بقای DNA در طول هضم

تجزیه و تحلیل داده ها

پوسیده خواری (Scavenging) و شکارگری ثانویه

دستورالعمل های آینده

چکیده

تجزیه و تحلیل مولکولی شکار، از طریق تکثیر واکنش زنجیره ای پلیمراز باقیمانده ی شکار در مدفوع یا سیستم گوارشی شکارگرها، حوزه ای است که به سرعت در حال رشد است که نداشتن اطلاعات در دسترس در مورد بهترین فعالیت ها مانع آن می شود. در اینجا، تکنیک های مورد استفاده به روز بررسی شده و دستورالعمل هایی برای افراد جدید وارد شده به این حوزه و یا افرادی با پس زمینه های دیگر از زیست شناسی مولکولی ارائه می شود. بهینه سازی با جمع آوری مزرعه ای، حفظ، تشریح شکارگر و تکنیک های استخراج DNA، که تمام آن ها برای اطمینان از کیفیت خوب طراحی شده اند و DNA آلوده نشده از نمونه های نیمه هضم شده آغاز می شود. مزایای استفاده از DNA هسته ای در مقابل DNA میتوکندریایی به عنوان اهداف پرایمر، به همراه انتخاب زن ها و مشاوره در مورد طراحی پرایمر برای به حداکثر رساندن اختصاصی بودن و زما ن های ردیابی پس از هضم شکار توسط شکارگر مرور شده است. بهینه سازی پرایمر و روش، از جمله آزمون های تکثیر متقاطع و آزمون های تغذیه ای تنظیمی مورد بحث قرار گرفته است.پس از ساخته شدن پرایمر، باید غربالگری نمونه های مزرعه ای (از طریق کنترل های مناسب) برای جلوگیری از آلودگی متقاطع انجام شود. واکنش های PCR مولتی پلکس، روش هایی را برای غربالگری همزمان بسیاری از گونه-های مختلف فراهم می کند. در مورد امپلیکون ها روی ژل ها، با یا بدون استفاده از پرایمرهای فلوروسنت نیز بحث شده است. در زمینه های تخصصی تر، ما کاربرد الکتروفورز زل گرادیانت دمایی و دناتوره را برای بررسی پاسخ شکارگرها به تنوع شکار بررسی کرده و پتانسیل سیستم های PCR کمی را برای کمی سازی شکارگری مرور کردیم. بر مسیرهای جایگزین که با آن ها DNA شکار ممکن است وارد معده شکارگر شود (لاشه خواری، شکارگری ثانویه) نیز تاکید شد. تکنولوژی های جدید مثل ریزآرایه و pyrosequencing، که ممکن است روزی در این زمینه استفاده شود، نیز بیان شد.

دستورالعمل های آینده
استفاده از سیستم های تشخیص PCR مبتنی بر ژل، برای نظارت بر شکارگری در یک گونه شکار یا گونه های کمی از شکار، گسترش می یابد. با این حال، استفاده از ژنومیکس بی مهرگان برای گسترش سیستم های ردیابی هدف که باعث شناسایی محدود کامل شکار حتی از گونه های بسیار عمومی در جوامع زیستی می شود، حائز اهمیت است، به این دلیل که نرخ شکار شدن گونه های هدف (مانند آفات کشاورزی)، به شدت تحت تاثیر انتخاب شکار و تراکم نسبی گونه های شکار جایگزین است (Symondson et al. 2002b). هر چه پیش می رویم، این مسیر عمدتا توسط هزینه محدود می شود، نه تکنولوژی. تا به امروز، استفاده از روش های مولتی پلکس با پرایمرهای برچسب گذاری شده با فلوروسنت، به عنوان نزدیک ترین روش شناخته شده است (Harper et al. 2005)، که برای ردیابی و شناسایی ۲ هدف به طور همزمان میریت شده است. با این حال، تکنولوژی ریزآرایه در حال حاضر به خوبی در حال استفاده است که عملکرد آن شناسایی ده ها هزار هدف در یک چیپ مبتنی بر سطح است. فرمت-های مختلفی از آن وجود دارد که به طور گسترده برای ردیابی ویرو س ها و باکتری ها در تشخیص های پزشکی (مقاله مروری Striebel et al. 2003) و شناسایی قارچ ها و سایر پاتوژن های گیاهی (Lievens et al. 2005; Szemes et al. 2005) استفاده می شوند. ریزآرایه های مبتنی بر Bead نیز در دسترس هستند، که در آن ها DNA به گزارشگرهای برچسب گذاری شده با فلوروسنت موجود روی Bead ها هیبرید شده و به طور انفرادی توسط لیزر خوانده می شوند (Armstrong et al. 2000).

Abstract

Molecular analysis of predation, through polymerase chain reaction amplification of prey remains within the faeces or digestive systems of predators, is a rapidly growing field, impeded by a lack of readily accessible advice on best practice. Here, we review the techniques used to date and provide guidelines accessible to those new to this field or from a different molecular biology background. Optimization begins with field collection, sample preservation, predator dissection and DNA extraction techniques, all designed to ensure good quality, uncontaminated DNA from semidigested samples. The advantages of nuclear vs. mitochondrial DNA as primer targets are reviewed, along with choice of genes and advice on primer design to maximize specificity and detection periods following ingestion of the prey by the predators. Primer and assay optimization are discussed, including crossamplification tests and calibratory feeding experiments. Once primers have been made, the screening of field samples must guard against (through appropriate controls) cross contamination. Multiplex polymerase chain reactions provide a means of screening for many different species simultaneously. We discuss visualization of amplicons on gels, with and without incorporation of fluorescent primers. In more specialized areas, we examine the utility of temperature and denaturing gradient gel electrophoresis to examine responses of predators to prey diversity, and review the potential of quantitative polymerase chain reaction systems to quantify predation. Alternative routes by which prey DNA might get into the guts of a predator (scavenging, secondary predation) are highlighted. We look ahead to new technologies, including microarrays and pyrosequencing, which might one day be applied to this field.

Future directions

The use of gel-based PCR detection systems to monitor predation on single or small numbers of prey species will continue to expand. However, the real prize will be to exploit invertebrate genomics to develop mass-target detection systems, allowing us to identify the complete prey range even of highly generalist species in biodiverse communities. This is important, because rates of predation on a target species (such as an agricultural pest) are strongly affected by prey choice and the relative densities of alternative prey species (Symondson et al. 2002b). How far we go down this route is currently limited mainly by cost rather than technology. To date, the nearest approach has been through the use of multiplexing with fluorescentlabelled primers (Harper et al. 2005), which managed to detect and identify up to 12 targets simultaneously. However, microarray technology is now well established, with the potential to identify tens of thousands of targets on a single surface-based chip. There are many formats available and these are used extensively to detect viruses and bacteria in medical diagnostics (reviewed in Striebel et al. 2003) as well as the identification of fungi and other plant pathogens (Lievens et al. 2005; Szemes et al. 2005). Bead-based microarrays are also available, in which DNA is hybridized to fluorescent-labelled reporters on the beads which are read individually by laser (Armstrong et al. 2000).

تصویری از مقاله ترجمه و تایپ شده در نرم افزار ورد

آنالیز مولکولی شکار: بررسی بهترین شیوه برای رویکردهای مبتنی بر DNA

Molecular analysis of predation: a review of best practice for DNA-based approaches