دانلود رایگان ترجمه مقاله توالی یابی DNA ( وایلی 2012)

مبتدی (مناسب برای درک مفهوم کلی مطلب) 

طول خوانش قابل مقایسه و افزایش ظرفیت رشته در مقایسه با توالی سنتی sanger تعیین توالی موازی فشرده با استفاده از pyrosequencing را برای توالی de novo، تعیین دوباره توالی ژنوم و مطالعات متاژنومیک ایده ال کرده است[12]. جیمز واتسون، که به حل ساختار DNA کمک کرده است، ژنومش را در سال 2008 با استفاده از pyrosequencing تعیین توالی کرده بود[13]. مهمترین اثر این پلتفرم توالی را می توان با مقایسه توالی ژنوم واتسون -تنها در دو ماه با هزینه 1 میلیون دلاری تکمیل شد [13] – با تلاش-های HGP، در زمان 11 سال و هزینه 3 میلیارد دلاری متوجه شد[14]. نقطه عطف دیگر با استفاده از pyrosequencing در تعیین توالی موازی فشرده کاری است که در ژنوم نئاندرتال توسط پابو و همکاران انجام شد[15]. به تازگی، طول خوانش پلتفرم از 450 پایه به 700 پایه توالی معمول sanger افزایش یافته است. تعیین توالی موازی فشرده با pyrosequencing بعلت افزایش توان عملیاتی بر توالی sanger بسیار برتری یافته است. با این حال، جامعه پژوهش به نظر می رسید اشتهای سیری ناپذیری را برای داده های توالی است توسعه داده است که به راحتی در مورد استفاده از زیست تابش SBS راضی نمی شدند.

3.2.SBS نابودگر رنگ برگشت پذیر
سود اساسی در توان عملیاتی تعیین توالی زمانی که دو سیستم تعیین توالی موازی فشرده برای مصارف تجاری در سال 2006 راه اندازی شد به دست آمد. این تکنولوژی مبتنی بر SBS با استفاده از رنگ پایان دهی نوکلئوتید برگشت پذیر چهار طیفی است و برای اولین بار در سال 2001 توسط یک شرکت کوچک، Solexa [16، 17]، که بعدها توسط ILLUMINA ]18] به دست آمد تعیین شده بود.
SBS با استفاده از پایان دهی رنگ قابل برگشت با تکه تکه شدن DNA و اتصال آداپتورها آغاز می شود. به جای استفاده از امولسیون PCR برای تفکیک فضایی هر الگوی DNA ، در رویکرد pyrosequencing تعیین توالی موازی فشرده، روش دیگری بکار گرفته می شود. الگوهای DNA از طریق آداپتورها به یک سطح مسطح هیبریده می شوند، جایی که که در آن هر الگوی DNA بطور کلونال توسط PCR فاز جامد تقویت می شود، همچنین به عنوان تقویت پل شناخته می شود. این، سطحی را با یک چگالی بالا از خوشه های فضایی مجزا ایجاد می کند، که هر خوشه شامل یک الگوی DNA منحصر به فرد است. این ها در ابتدا با عبور پایان دهنده های رنگ برگشت پذیر چهار طیفی مجزا در یک جریان محلول بر روی سطح در حضور یک پلیمراز DNA تعیین توالی می شوند. فقط گسترش های تک پایه ای با توجه به اصلاح پریم3 از نوکلئوتیدهای پایان دهی زنجیره ممکن است ، و هر خوشه شامل فقط یک نوع از نوکلئوتیدهاست، همچنانکه بوسیله الگوی DNA تشکیل دهنده خوشه دیکته شده است. پایه گنجانده شده در تمام خوشه ها توسط تصویربرداری فلورسانس از سطح قبل از حذف شیمیایی رنگ و ترمیناتور شناسایی می شود، پایه قابل گسترش که برای دور جدیدی از توالی آماده است تولید می شود. رایج ترین خطاهای توالی تولید شده در SBS پایان دهی رنگ برگشت پذیر جانشینی ها هستند [18، 19].
یکی از اشکالات عمده شیمی پایان دهی رنگ برگشت پذیر محدودیت در طول خواندن است، بطوریکه رسیدن به بهره وری 100٪ از اختلاط پایه ها و شکافتگی در هر چرخه دشوار است. هنگامی که سیستم راه اندازی شد، کیفیت بالای خواندن طول تنها 30-36 پایه را نمایان کرد[18، 20]، که به طور چشمگیری کمتر از طول خواندن ارائه شده توسط هر دو توالی sanger و pyrosequencing برای تعیین توالی موازی فشرده بود. در واقع، آن حتی کمتر از طول خواندن روش “plus-minus” که در سال 1975 بوسیله سنگر و کولسون توسعه داده شد بود[21]، اما یک افزایش چشمگیر در خروجی داده های توالی این اشکال را جبران کرد. پیشرفت های قابل توجهی در هر دو زمینه طول خواندن و توان عملیاتی از زمان معرفیش به دست آمده است، که SBS پایان دهی رنگ برگشت پذیر را قادر می سازد تبدیل به موفقترین پلتفرم تعیین توالی موازی فشرده شود. طول خواندن کوتاه در ابتدا استفاده از آن در اپلیکیشن های اسمبلی بزرگ de novo را ممنوع کرد، اما آن را برای توالی مجدد و اپلیکیشن های شمارش داده ، به عنوان مثال توالی ترنسکریپتومیس، RNA-SEQ و تعیین توالی قطعات DNA که در فعل و انفعالات پروتئین DNA درگیر هستند، ChIP-Seq مناسب کرده است[18]. بهبود در طول خواندن و توسعه الگوریتم های اسمبلی de novo، مانند SOAP de novo [22] در حال حاضر استفاده از SBS پایان دهی رنگ برگشت پذیر را در اسمبلی de novo ژنوم پستانداران بزرگ، به عنوان مثال، ژنوم پاندا را امکان پذیر کرده است[23]. به تازگی، ILLUMINA سیستم سریعHiseq 2500 خود را ارائه کرده است که قادر به تعیین توالی ژنوم انسان در 27 ساعت، و فعال کردن طول خواندن اطلاعات تا 150 پایه از طریق چرخه های زمانی کوتاه تر توالی است.

3.3. توالی بوسیله زنجیره لیگاسیون
در طبیعت، لیگازهای DNA آنزیم های ضروری برای تعمیر شکاف ها و شکستگی های DNA هستند و در واکنش های ترمیم و همانندسازی DNA نقش دارند [24]. در سال 2005، Church and Shendure نشان داند که واکنشی که آن ها کاتالیز می کنند می تواند برای توالی قطعات DNA کوتاه ساکن بر روی دانه-های به دام افتاده در ژل پلی آکریل آمید در فرآیندی به نام توالی polony استفاده شود ]25]. (SOLiD(Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection سومین پلتفرم تجاری توالی موازی فشرده ، بر اساس یک نسخه پیچیده تر از این روش، در سال 2007 به بازار 2007 آمده است[26].
در ابتدا، پلتفرم SOLiD بسیاری از پایه های پلتفرم ILLUMINA را به همراه داشت، اما ارتقاء های اخیر در مقابلchemistry Hiseq2000، را عملکرد این ابزار را به طور قابل توجهی بالاتر از SOLiD برده است با این حال، در مراحل آماده سازی کتابخانه، پلتفرم SOLiD شبیه تعیین توالی فشرده موازی با pyrosequencing است. تقویت کلونال با استفاده از امولسیون PCR پس از ایجاد یک کتابخانه adaptor-ligated به دست می آید. دانه های غنی شده سپس روی اسلاید شیشه ای بطور تصادفی ته نشین شده با یک اصلاح 3 پریم به اهداف معرفی شده که پوشش دهنده دانه ها هستند متصل شدند. در توالی های بعدی با chained لیگاسیون، الیگومرهای هشت نوکلئوتید، اکتامرها، به عنوان پروب تشخیص به جای تک نوکلئوتید استفاده می شود. هر اکتامر شامل دو پایه شناخته شده در انتهای 3 پریم است که با سه نوکلئوتید دژنره و سه نوکلئوتید دیگر که می تواند با هر هر نوکلئوتید دیگری هیبرید شود، به نام نوکلئوتید یونیورسال شناخته می شود. چهار رنگ بطور طیفی مجزا به کار گرفته می شوند، که هر کدام توسط چهار اکتامر حمل می شوند و یک مجموعه پروب متشکل از 16 اکتامر، تمام ترکیبات ممکن دو پایه شناخته شده را پوشش می دهند. رنگ به انتهای 5 پریم هر اکتامر متصل می شود. برای شروع چرخه توالی اول، دانه های پوشش دهنده DNA با یک پرایمر توالی ، 16 پروب اکتامر و لیگاز انکوبات می شوند. فقط یک پروب کاملا هیبرید شده به پرایمر توالی توسط لیگاز خواهد پیوست. پروب ها دو پایه اول را رمزگشایی می کنند ، و سپس بطور شیمیایی شکافته خواهند شد تا اخرین سه پایه 5 پریم حذف شوند. این چرخه از هیبریداسیون و لیگاسیون پروب، تصویربرداری فلورسنت و شکافت شیمیایی ده بار تکرار می شود برای تحقیق در مورد تمام پایه های پنجم. قطعات ایجاد شده سپس از دانه ها تهی می شوند و یک دور لیگاسیون دوم با استفاده از توالی پرایمر انیلینگ یک پایه بالادست از قبلی انجام می شود. از این رو، هر پایه به دو رنگ فراخوانی مرتبط است. به تدریج تغییر موقعیت پرایمر توالی و تکرار بستن دور لیگاسیون با استفاده از ده چرخه در هر بار منجر به فراخوانی رنگ می شود، که می تواند برای به دست آوردن یک دنباله خطی در فضای رنگ رمزگشایی شود. ترجمه از فضای رنگ به یک توالی نوکلئوتیدی عادی با بیشترین دقت بوسیله همترازی خوانش فضای رنگ به یک ژنوم مرجع فضای رنگ انجام می شود. به عنوان یک نتیجه از همترازی فضای رنگ، اشتباهات می تواند بطور موثری اصلاح شود از آنجایی که تنها ترکیبات رنگی خاصی مجاز است، تسهیل تمایز بین جانشینی نوکلئوتید، نمایانگر یک تغییر دو رنگه در نوکلئوتیدهای مجاور و اشتباهات توالی است [26-28]. رایج ترین خطاها در تعیین توالی با زنجیره لیگاسیون قابل تعویض هستند [18].
Life Technologies به تازگی یک جایگزین برای مرحله پرزحمت اماده سازی کتابخانه امولسیون با یک تکنیک به نام wildfire ارائه کرده است که شبیه تقویت پل در پلت فرم ILLUMINA است که وعده کاهش زمان اماده سازی کتابخانه زمان آماده سازی و همچنین چگالی بالاتر روی سطح تراشه را می دهد که توان عملیاتی بالاتر را ممکن می سازد. سیستم SOLiD بهترین مورد برای پروژه های تعیین توالی است که نیاز به نرخ خطای پایین [26]، تعیین توالی ترانسکریپتوم و شمارش برچسب ها دارد، به عنوان مثال ChIP-Seq با توجه به طول خواندن کوتاهش، سیستم تصحیح خطا و خروجی انبوهی از داده ها [18] . رویکرد فضای رنگی بطور موثری خطاهای توالی را اشکار می کند، اما ثابت شده است تجزیه و تحلیل داده های پایین دستی دست و پا گیر است که منجر به توسعه چند ابزار اپن سورس مرتبط شده است [29]. با این حال، بهره برداری از واکنش لیگاسیون در توالی بدون استفاده از رویکرد فضای رنگی ممکن است .

3.4. توالی با استفاده از لیگاسیون حذف زنجیره
در سال 2010، Complete Genomics Inc یک مقاله چاپ کرد و قابلیتهایش در تعیین توالی کامل ژنوم انسان با استفاده از متد تعیین توالی با استفاده از روش به اشتراک گذاری چندین ویژگی با توالی polony را نشان داد[25، 30]. به جای فروش ابزارهای تعیین توالی، که تاکنون مدل کسب و کار غالب بوده است، شرکت خدمات برون سپاری برای تعیین توالی DNA انسان شامل آماده سازی کتابخانه، تعیین توالی و تجزیه و تحلیل عمومی را فراهم می کند.
Complete Genomics تعیین توالی لیگاسیون حذف زنجیره را با استفاده از فن آوری ترکیبی خود probe-anchor ligation (cPAL) انجام می دهد. DNA برای تعیین توالی به 500 پایه خرد می شود و چهار آداپتور به هر بخش از ژنومیک از طریق برش های مکرر با آنزیم های محدود و لیگاسیون درون مولکولی فرستاده می شود. چرخه های منتجه پس از آن در محلول به رول های تک رشته ای DNA تقویت می-شوند[31]، که نانوتوپ های DNA نامیده می شود، که متتشکل از نسخه های مکرر چرخه های اصلی است. نانوتوپ های DNA سپس به طور تصادفی به نقاط دستور داده شده بر روی یک سطح مسطح متصل می-شوند. هر نقطه به اندازه کافی کوچک فقط شامل یک نانوتوپ DNA است. رویکرد Complete Genomics در تعیین توالی با لیگاسیون حذف زنجیره از یک پروب لنگری برای پیدا کردن موقعیت آداپتورها و پروب تشخیص شامل نه پایه (nonamers) و چهار رنگ استفاده می کند. پروب لنگری و پروب تشخیص توسط هیبریداسیون و لیگاسیون متصل شده اند تا یک پایه هر چرخه را رمزگشایی کنند. نانوتوپ ها می توانند رمزگشایی شوند، یک نوکلئوتید در هر لحظه، در هر دو طرف موقعیت آداپتور. به طور خلاصه، یک الیگونوکلئوتید لنگری با یکی از چهار آداپتور هیبرید می شود، و چهار پروب، هر کدام حامل یک رنگ طیفی مجزا حمل می کنند برای تحقیق از یک موقعیت پایه مجاور به آداپتور استفاده می شود. رنگ به یک پایه شناخته شده در یک وضعیت خاص در پروب نونامر متصل می شود در حالی که بقیه موقعیت ها توسط نوکلئوتیدهای دژنره پر شده است. تغییر موقعیت پایه شناخته شده در پروب موقعیت های 1-5 در الگوی DNA اجازه می دهد تا در مجاورت آداپتور خوانده شوند. ایجاد یک پروب لنگری بسط یافته با لیگاسیون دو پروب لنگری اجازه می دهد تا رمزگشایی از مواضع 6-10 مجاور آداپتور انجام شود. مجموعه لنگر- پروب پس از اشکارسازی فلورسنت هر هیبریداسیون و واکنش لیگاسیون تکمیل می شود. این سیستم را بازنشانی می کند. از این رو، هر فراخوانی پایه از زنجیره رها می شود، در نتیجه کیفیت توالی بهبود می یابد زیرا هر پایه رمزگشایی شده مستقل از کامل بودن چرخه های قبلی است. کل پروسه سپس برای هر دو طرف هر سایت آداپتور تکرار می شود، و در نتیجه 10-mers ها در خوانش 35 پایه-زوج- پایان ادغام می شوند[30].
دلایلی که Complete Genomics در حال نگه داشتن پلتفرم توالی آنها در خانه هستند، حداقل بطور جزئی، مربوط به چالش قابل توجه نقشه برداری و مونتاژ ژنوم انسان بسیار تکراری با استفاده از خوانش 35-پایه-زوج- پایان کوتاه و نسبتا خواستار اماده سازی کتابخانه cPAL است. ILLUMINA به ابتکار Complete Genomics با تعیین توالی کامل ژنوم انسان به عنوان یک سرویس با استفاده از شیمی پایان دهی رنگ بازگشت پذیر پاسخ داده است. آن باقی می ماند تا دیده شود ایا بیشترین تعیین توالی در بیمارستان ها و مراکز تعیین توالی انجام خواهد شد، و یا به شرکت های تعیین توالی برون سپاری خواهد شد.

SBS 3.5. حساس یونی
تمام پلتفرم های تعیین توالی موازی فشرده تاکنون از اشکارساز نوری برای کشف یک توالی DNA. استفاده می کنند. تبادل تشخیص نوری با تشخیص الکتریکی به طور بالقوه چندین مزیت دارد چرا که این امر از نیاز به نوکلئوتید اصلاح شده، اپتیک گران و اکتساب وقت گیر و پردازش مقادیر زیادی از داده های تصویر فلورسنت جلوگیری می کند. از این رو، آن وعده تعیین توالی ارزان تر، کارآمدی فضایی و سرعت بیشتر را می دهد. پورمند و همکارانش [32] یک روش SBS تشخیص الکتریکی در سال 2006 ارائه کردند، که نشان می دهد که رویدادهای سنتز DNA را می توان با استفاده از آشفتگی بار الکتریکی با استفاده از یک تقویت کننده ولتاژ جهشی، شناسایی کرد. در سال 2010، روتبرگ و همکارانش [33] یک پلتفرم ابتکاری تعیین توالی بر اساس کار پورمند و همکارانش [34]، از جریان یونی که متکی بر سیگنال های الکتریکی به جای فلورسنت برای بدست آوردن اطلاعات توالی استفاده کردند.
این فرایند بسیار شبیه به ان چیزی است که قبل از آن توسط روتبرگ و همکاران برای تعیین توالی موازی فشرده با pyrosequencing توسعه یافته است. این شامل استفاده از همان مراحل آماده سازی کتابخانه، با یک کتابخانه قطعه adaptor-ligated است، که بطور کلونال بر روی دانه ها با استفاده از روش PCR امولسیون تقویت می شود.یک پلیمراز DNA برای ترکیب نوکلئوتیدها روی یک الگوی DNA پرایم شده با یک جریان از پیش تعیین شده از نوکلئوتیدها استفاده می شود. با این حال، تمرکز از PPI به دیگر محصول ترکیب نوکلئوتید، یون هیدروژن تغییر می یابد. دانه های غنی شده از امولسیون PCR در چاه های کوچک روی تراشه یونی ته نشین می شوند (هر یک مجهز به یک سنسور است که قادر به تشخیص پروتون آزاد است). همچنانکه پلیمراز DNA نوکلئوتید را به الگویDNA اضافه می کند، یونهای هیدروژن ازاد می شوند، و در نتیجه تغییر مکان پروتون ازاد است توسط سنسور تشخیص داده شده و به یک سیگنال الکتریکی تبدیل می-شود. تراشه یونی که مبتنی بر فنآوری است که به طور گسترده برای ساخت مدارهای مجتمع استفاده می شود ، تولید کم هزینه، و در مقیاس بزرگ را تسهیل می کند و باید مقیاس پذیری عالی را اعطا کند. با این حال، به مانند تعیین توالی موازی فشرده با pyrosequencing ، نواحی homopolymeric منجر به افزایش حذف و الحاق، با توجه به پاسخ الکتریکی غیرخطی بر ترکیب بیش از پنج نوکلئوتید می شود[33].