دانلود رایگان ترجمه مقاله بیوسنسور DNA الکتروشیمیایی برای تشخیص ژن E6 ویروس پاپیلوم انسانی – الزویر 2016

مقاله انگلیسی رایگان

ترجمه فارسی رایگان 

فهرست مقاله:

1-مقدمه
2- مواد و روش ها
2-1 مواد
2-2 ساخت باکتری های نوترکیب
2-3 لوازم و دستگاه ها
2-4 فعال سازی PGE
2-5 تثبیت پروب بر روی PGE
2-6 هیبریدیزاسیون
2-7 اندازه گیری های الکتروشیمیایی
2-8 تحلیل آماری
3-نتایج و بحث
3-1 ساخت پلازمید نوترکیب pGEM-T/E6
3-2 تشخیص الکتروشیمیایی pGEM-T/E6
3-2-1 اثر پیش تیمار بر روی سطح PGE
3-2-2 اثر غلظت پروب
3-2-3 تشخیص هیبریدیزاسیون
3-2-4 عملکرد تحلیلی سنسور
3-2-5 مطالعه رفتار انتخابی در شرایط بهینه
3-3 تحلیل بیوسنسور در برابر الکتروفورز برای تشخیص اسید نوکلئیک
4-نتیجه گیری

بخشی از ترجمه فارسی مقاله:

1-مقدمه
بیش از 160 نوع ویروس پاپیلومای انسانی شناخته شده(HPV) وجود دارد( بارک و همکاران 2013) که از این تعداد 40 مورد از آن ها می توانند اپیتلیوم آنوژنیتال را عفونی کنندو از این تعداد 15 ویروس به صورت سرطانی در نظر گرفته می شوند( لین و همکاران 2010). HPV 16-18 که به صورت انواع با ریسک بالا (HR) طبقه بندی می شوند، عامل تقریبا 60-80 درصد وقوع سرطان دهانه رحم در سرتاسر دنیا می باشند(کارتر و همکاران 2011، هندری و همکاران 2013).
چندین مطالعه نشان داده است که HPV دو آنکوژن قوی E6 و E7 را رمز گذاری می کند. این انکوژن ها به طور پیوسته در HPV-HR بیان شده و عامل ترانسفورماسیون بدخیم سرطان دهانه رحم می باشند( عظم و شمس الاسلام 2010، باکاردو و همکاران 2010، کارتر و همکاران 2011، استانلی 2010، ویکی و همکاران 2014). از این روی ژن های E6 و E7 بیانگر اهداف ایده ال برای تولید واکسن های درمانی بوده و به طور بالقوه موجب حذف زخم های قبلی و تومور های بدخیم با تولید ایمنی سلولی در برابر سلول های آلوده به HPV می شود( هوانگو همکاران 2010، کاوانا و همکاران 2012، نیتو و سالوتی 2014).
پیشرفت در زمینه فنون کلونینگ مولکولی، امکان تولید سریع، آسان و ارزان واکسن های وکتور نوترکیب را فراهم کرده است( هوانگ و همکاران 2010، هوانگ و همکاران 2008). واکسن های وکتور نوترکیب دارای مزیت های بسیاری نسبت به واکسن های سنتی هستند و یک راه حل تکنولوژیک برای میکرو ارگانیسم هایی هستند که به سختی در کشت بافت سلولی و یا مدل های حیوانی نظیر HPV رشد می کنند( فرارو و همکاران 2011، لین و همکاران 2010، ما و همکاران 2010).
رایج ترین روش مورد استفاده برای تحلیل کلونینگ مولکولی،روش الکتروفورز در ژل های آگاروز است. با این حال، این روش مستلزم پرسنل آموزش دیده بوده و زمان بر می باشد( چانگ و همکاران 2013، تلس و فونکسا 2008). بیوسنسور های DNA به فراوانی برای تشخیص توالی DNA ویژه استفاده می شوند( پی وهمکاران 2013، توسار و همکاران 2010)، با این حال کم تر در خصوص تحلیل کلونینگ بررسی شده است. در این مطالعه، ما به توصیف یک بیوسنسور جدید، ساده،ارزان، پایدار و بدون برچسب الکتروشیمیایی DNA برای تشخیص ژن HPV 16 E6 کلونشده در وکتور بیان کننده می پردازیم.
2- مواد و روش ها
2-1 مواد
DH5a اشریشیا کولای ( اینویتروژن-آمریکا) و pGEM-T Easy (pGEM-T)( پرومگا-آمریکا) به ترتیب به عنوان وکتور های میزبان و کلونینگ استفاده شدند. کشت باکتری در یک محیط (LB) لوریا برتانی ( تریپتون 10 گرم بر لیتر، عصاره مخمر 5 گرم بر لیتر، سدیم کلرید 10 گرم بر یتر، اسیدیته 7) مکمل سازی شده با 100 میلی گرم بر لیتر امپی سیلین، 160 میکرو گرم بر میلی لیتر X-gal و 0.5 میلی مول IPTG(ایزوپروپیل b-D-1—تیوگلاکتوپیرانوزید) انجام شد.لیگاز T4 DNA، نشانگر اندازه DNA و آنزیم های محدود کننده EcoRI, XbaI و ApaI از اینویتروژن- ایالات متحده خریداری شدند. کیت تخلیص QIAquick PCR و DNA پلیمراز از شرکت کلونتک آمریکا و QIAgen آلمان خریداری شد.
سرب مداد( نوع 4B)، که متشکل از گرافیت طبیعی، یک بایندر(سیمان) پلیمری و رس با درصد های متفاوت است، به عنوان الکترود گرافیت مدادی استفاده شد(PGE).
الیگنوکلوئوتید عاری از گرانیت 23-mer (50-ATI CAC CAA AAI AIA ACT ICA AT-30 ,) خریداری شده از فناوری های DNA یکپارچه-USA) متناظر با رشته سنز ژن HPV 16 E6 به عنوان پروب HPV استفاده شد.
محلول های الیگونوکلوئوتید و محلول های رقیق پلازمید ها برای بافر استات 0.5 مول ( اسیدیته 5) تهیه شده و به منجمد شدند.

بخشی از مقاله انگلیسی:

Abstract

In the current study, we describe a novel, simple, inexpensive, sensitive, specific, stable and label-free electrochemical DNA biosensor used to identify a target gene cloned into a plasmid. The biosensor was designed with a 23-mer oligonucleotide of guanine-free, which was immobilized on the pencil graphite electrode (PGE) for E6 gene detection from human papillomavirus 16 type (HPV16). The E6 gene was used due to its clinical importance. The optimal probe concentration was obtained in 500 nM. The hybridization detection showed a good linearity in the range of 40–5,000 pg/lL with a detection limit of 16 pg/lL. The electrochemical method showed higher sensitivity and specificity when compared with the agarose gel electrophoresis assay. This technology could be postulated as a new and attractive alternative for cloning analysis in plasmids.

1. Introduction

There are over 160 known types of human papillomavirus (HPV) (Burk et al., 2013), of which 40 can infect the anogenital epithelium and of these 15 are considered oncogenic (Lin et al., 2010). The HPV 16 and 18, classified as high-risk types (HR), are responsible for approximately 60–80% of cervical cancer occurrence worldwide (Carter et al., 2011; Hendry et al., 2013). Several studies show that HPV encodes two powerful oncogenes, E6 and E7. These oncogenes are constantly expressed in the HR-HPV and are responsible for the malignant transformation of cervical cancer (Azam and Shams-ul-Islam, 2010; Boccardo et al., 2010; Carter et al., 2011; Stanley, 2010; Vici et al., 2014). Therefore, the E6 and E7 genes represent the ideal targets for development of therapeutic vaccines, which potentially eliminate pre-existing lesions and malignant tumors by generating cellular immunity against HPV-infected cells (Huang et al., 2010; Kawana et al., 2012; Nieto and Salvetti, 2014). Progress in the molecular cloning techniques has enabled the relatively quick, easy and cheap manufacture of recombinant vector vaccines (Huang et al., 2010; Hung et al., 2008). Recombinant vector vaccines have many advantages over conventional vaccines and may provide a technological solution for microorganisms that have difficulty growing in cell culture or animal models, like HPV (Ferraro et al., 2011; Lin et al., 2010; Ma et al., 2010). The most popular technique used for molecular cloning analysis is the electrophoresis method in agarose gels. However, this technique requires well-trained personnel and is time-consuming (Chang et al., 2013; Teles and Fonseca, 2008). DNA biosensors are commonly employed to detect a specific DNA sequence (Pei et al., 2013; Tosar et al., 2010), but less explored for cloning analysis. In the current study we describe a novel, simple, inexpensive, stable and label-free DNA electrochemical biosensor for the detection of HPV 16 E6 gene cloned in the expression vector.

2. Materials and methods

2.1. Materials

Escherichia coli DH5a (Invitrogen – USA) and pGEM-T Easy (pGEM-T) (Promega – USA) were used as host and cloning vectors, respectively. Bacterial growth was performed in a Luria–Bertani (LB) medium (tryptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L and NaCl 10 g/L, pH 7.0), supplemented with 100 mg/ L ampicillin, 160 lg/mL X-gal and 0.5 mM IPTG (Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside). T4 DNA ligase, DNA size marker and EcoRI, XbaI and ApaI restriction enzymes were purchased from Invitrogen – USA. DNA polymerase and QIAquick PCR Purification Kit were supplied from Clontech Company – USA and QIAgen – Germany, respectively. Pencil lead (type 4B), commonly composed of natural graphite, a polymeric binder and clay in different percentages, was used as pencil graphite electrode (PGE). The 23-mer, guanine-free oligonucleotide (50 -ATI CAC CAA AAI AIA ACT ICA AT-30 , purchased from Integrated DNA Technologies – USA), correspondent to the sense strand of the HPV 16 E6 gene, was employed as HPV probe. The oligonucleotide solutions and dilute solutions of the plasmids were prepared with 0.5 M acetate buffer (pH 5.0) and kept frozen.