دانلود ترجمه مقاله تشخیص مولکولی بهبود یافته کووید 19 با روش جدید، بسیار حساس و اختصاصی COVID-19-RdRp/Hel رونویسی معکوس-PCR (سال 2020)

تشخیص مولکولی بهبود یافته کووید 19 با روش جدید، بسیار حساس و اختصاصی COVID-19-RdRp/Hel رونویسی معکوس-PCR در زمان واقعی که در شرایط آزمایشگاهی و با نمونه های بالینی تایید شده است

Improved Molecular Diagnosis of COVID-19 by the Novel, Highly Sensitive and Specific COVID-19-RdRp/Hel Real-Time Reverse Transcription-PCR Assay Validated In Vitro and with Clinical Specimens

چکیده
مواد و روش ها
نتایج
بحث
منابع

چکیده
در 31 دسامبر 2019، سازمان بهداشت جهانی از گروهی از موارد واگیردار ناشی از علل ناشناخته در ووهان چین باخبر شد. ارزیابی های بعدی یک کرونا ویروس جدید را شناسایی کردند که در حال حاضر بر اساس بیماران تحت تاثیر قرارگرفته، سندرم شدید حاد تنفسی کرونا ویروس 2 (SARS-CoV-2) نامگذاری شده است. تشخیص های به شدت حساس و خاص آزمایشگاهی برای کنترل سریع اپیدمی بیماری کرونا ویروس مرتبط با SARS-CoV-2 (COVID-19) حائز اهمیت هستند. در این مطالعه، ما عملکرد سه آزمایش جدید رونویسی معکوس در زمان واقعی-PCR (RT-PCR) را توسعه داده و مقایسه کردیم که هدف آن RNA پلیمراز وابسته به RNA، (RdRp)/helicase (Hel), spike (S) و ژن های نوکلئوکپسید (N) SARS-CoV-2 با موارد گزارش شده در آزمون RdRp-P2 بود که در بیش از 30 آزمایشگاه اروپا مورد استفاده قرار می گیرد. در میان این سه آزمایش جدید، تست COVID-19-RdRp/Hel دارای کمترین حد شناسایی در شرایط in vitro است (1.8 از 50% بافت کشت شده از دزهای آلوده شده [TCID50]/ml با RNA ژنومی و 11.2 واکنش/کپی از RNA در رونویسی in vitro در RNA). در میان 273 نمونه حاصل از 15 بیمار که در آزمایشگاه هونگ کونگ از نظر COVID-19 تایید شدند، 77 مورد (28.2%) آن ها از نظر تست COVID-19-RdRp/Hel و RdRp-P2 مثبت بودند. تست RdRp/Hel کووید19 برای 42 نمونه دیگر RdRp-P2-negative نیز مثبت بود (119/273 (43.6%) در مقابل 77/273 (28.2%)؛ P<0.001)، شامل 120/29 (24.2%) نمونه دستگاه تنفسی و 153/13 (8.5 %) نمونه های غیر از دستگاه تنفسی بوده است. میانگین حجم ویروس در این نمونه ها 3.21 ×104 رونوشت RNA/ml است ( در محدوده 2.21 ×102 تا 4.71 ×105 رونوشت RNA/ml). تست COVID-19-RdRp/Hel واکنش متقابلی با سایر کروناویروس های بیماری زای انسانی و عوامل بیماری زای تنفسی در کشت سلولی و نمونه های بالینی ندارد، در حالی که بین تست RdRp-P2 و SARS-CoV در کشت سلولی واکنش متقابل وجود دارد. تست به شدت حساس و خاص COVID-19-RdRp/Hel ممکن است به بهبود تشخیص آزمایشگاهی COVID-19 کمک کنند.

در 31 دسامبر 2019، سازمان بهداشت جهانی از گروهی از موارد واگیر یک بیماری ناشناخته در ووهان، استان هوبی در چین خبر داد (https://www.who.int/westernpacific/emergencies/covid-19). ارزیابی بعدی نشاندهنده یک کروناویروس جدید است که ارتباط نزدیکی با سندرم حاد تنفسی کرونا ویروس (SARS_CoV) در این بیماران دارد (1-3). این ویروس جدید اخیراً توسط گروه مطالعاتی کروناویروس در انجمن بین المللی رده بندی ویروس ها به نام سندرم حاد تنفسی کروناویروس 2 نامگذاری شده است (4). بیشتر بیماران مبتلا به آلودگی SARS-CoV-2 یا بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19) علائمی از تب شدید، درد عضله، سرفه و شواهد رادیولوژی از کدر شدن زمینه شفاف شش خبر می دهند که قابل مقایسه با بیماری ذات الریه است (5-7). با این وجود، موارد بدون علامت یا علامت خفیف نیز گزارش شده است (2، 8-10). ارزیابی های اپیدمیولوژی اولیه نشان داد که بازار خرده فروشی غذاهای دریایی هونان در ووهان به عنوان یک منبع مکانی مرتبط بوده، اما ارزیابی اپیدمیولوژی مفصل بعدی نشان داد که بیش از 45% موارد اخیر با بروز علائم قبل از 1 ژانویه 2020 ارتباطی با این بازار نداشتند (5.11). انتقال فرد به فرد در میان تماس نزدیک خانواده و کارکنان بخش مراقبت بهداشتی، از جمله افرادی که سابقه سفر به ووهان را داشتند، گزارش شد (2، 7، 12، 13). در نتیجه خصوصیات بالینی و ارتباط اپیدمیولوژی با ووهان به تنهایی برای تشخیص COVID-19 قابل اتکا نیست.

مواد و روش ها
ویروس ها و نمونه های بالینی. SARS-CoV-2 از یک بیمار در هنگ کنگ گرفته شد که COVID-19 آن در آزمایشگاه تایید شد (22). جدایه ویروس با یک قطعه اضافی در سلول های VeroE6 تکثیر شد تا یک استوک کاری از ویروس ساخته شود ( 1.8 ×107 یعنی 50% کشت بافت دزهای آلوده [TCID50]/ml). برای ارزیابی اختصاصیت در شرایط in vitro، آرشیو ایزوله های کشت آزمایشگاهی (n=17) در سایر کروناویروس های بیماریزای انسان و ویروس های تنفسی مورد استفاده از دپارتمان میکروبیولوژی دانشگاه هنگ کنگ که پیشتر توضیح داده شده به دست آمدند (23). همه پروتکل های آزمایشگاهی شامل SARS-CoV-2 زنده، SARS-CoV و MERS-CoV بودند که از روش اجرای استاندارد تایید شده در سطح 3 امکانات امنیت زیستی پیروی می کنند که پیشتر توضیح داده شد (24.25). برای ارزیابی بالینی، تعداد 273 نمونه بالینی (120 مورد از دستگاه تنفسی و 153 مورد از غیر دستگاه تنفسی) از 15 بیمار جمع آوری شد که COVID-19 آن ها در آزمایشگاه هنگ کنگ تایید شد که تست نمونه های آسپیرات/سواب، نازوفارنکس، سواب های گلو، و یا نمونه های خلط آن ها برای SARS-CoV-2 RNA از طریق آزمایش RdRp2 مثبت شد (22). علاوه بر این، عصاره نوکلئیک اسید کل در 22 نمونه ذخیره شده (ذخیره در -80 درجه تا زمان مصرف)، آسپیرات های نازوفارنکس/سواب ها و سواب-های گلو از 22 بیمار بالغ جمع آوری شدند که در بیمارستان هنگ کنگ از نظر علائم تنفسی زیاد/یا پایین مدیریت شده و این تست برای سایر عوامل بیماریزای تنفسی FilmArray RP2 مثبت بود (تشخیص BioFire، Salt Lake City, UT, USA) و بر اساس دستورالعمل کارخانه برای ارزیابی پتانسیل واکنش متقابل با سایر عوامل بیماریزای تنفسی در نمونه های بالینی مورد ارزیابی قرار گرفت. این مطالعه توسط بررسی صورت گرفته در دانشگاه هنگ کنگ/مدیریت بیمارستان تایید شد (UW 14-249).

استخراج اسید نوکلئیک. عصاره نوکلئیک اسید (TNA) در نمونه های بالینی و کشت سلول آزمایشگاهی در جدایه های ویروسی با استفاده از سیستم عصاره گیری NucliSENS easyMAG (bioMérieux,Marcy-l’Étoile, France) و بر اساس دستورالعمل کارخانه که پیشتر توضیح داده شده بود، انجام شد (24). حجم نمونه های مصرفی برای استخراج و حجم رقیق سازی به نوع نمونه و مقدار نمونه موجود بستگی دارد. به طور کلی، 250 lµ از نمونه دستگاه تنفسی، نمونه ادرار، سواب روده و مدفوع تحت عصاره گیری با یک حجم رقیق شده 55 lµ قرار گرفت و 100 lµ از هر نمونه پلاسما با حجم رقیق سازی 25 lµ عصاره گیری شد. عصاره حاصل تا زمان مصرف در 80- درجه سانتیگراد ذخیره شد. عصاره مشابه حاصل از هر نمونه برای همه RT-PCRها مورد استفاده قرار گرفت.